一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法技术

本发明专利技术公开了一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法；S1、选取实验耗材；S2、半抗原的改造，制备化合物A；S3、制备化合物B；S4、洛克沙胂人工抗原的合成；S5、人工抗原鉴定与多克隆抗体制备；S6、间接ELISA方法的建立；本发明专利技术以4

【技术实现步骤摘要】
一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法


[0001]本专利技术属于人工抗原制备
，具体涉及一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法。

技术介绍

[0002]合成抗原将氨基酸按一定顺序聚合成大分子多肽，使其具有抗原的性质，亦称合成多肽抗原。因其结构是已知的，故多用于蛋白质构型与抗原特性的关系和抗原抗体反应机理的研究，也可用以制备合成肽疫苗，洛克沙胂是用于畜禽促生长的一种最经济的多功能有机砷饲料添加剂，具有抗球虫、治痢疾、沉积色素、改善毛色、提高产蛋率、降低料肉比等功效，可与多种抗生素、促生长剂配合使用,洛克沙胂价格低廉，已广泛的应用在规模化的养鸡场中。洛克沙胂等砷类化合物具有一定毒性，可影响机体酶的活性，导致细胞代谢紊乱，进而容易造成中枢神经失调，亦可引起细胞DNA损伤。如果在饲养过程中洛克沙胂使用过量，必定会造成其在畜禽体内残留，严重威胁人类的健康，国内外文献中所报道的洛克沙胂残留检测方法多为高效液相色谱法、固相萃取
‑
高效液相色谱法、超高效液相色谱
‑
串联质谱法、高效液相色谱
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电感耦合等离子体
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串联质谱法、液相色谱
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氢化物发生
‑
原子荧光联用法等仪器方法，由于这些方法所需设备昂贵、操作复杂、耗费时间长，因此只适于实验室研究，不易推广。目前，关于洛克沙胂免疫学检测的文献报道较少，2011年，SHELVER以3
‑
氨基
‑4‑
羟基苯胂酸(AHPA)为半抗原修饰物，将AHPA与钥孔血蓝蛋白偶联，合成了洛克沙胂的人工抗原，建立了一种鸡肉中洛克沙胂的间接ELISA检测方法，该方法的IC50为12.0
±
2.45ng/mL。2019年，刘红亮等采用碳二亚胺法将AHPA与BSA偶联，该抗体对洛克沙胂的IC50为3.147ng/μL，但未对实际样品进行检测。为了探索最适的免疫学检测方法，有必要通过多种方法合成洛克沙胂的多种人工抗原，筛选出一种具有高活性的人工抗原，更大程度的提高ELISA检测的特异性和灵敏度，以便于进一步应用和推广，然而市面上各种的洛克沙胂的多种人工抗原仍存在各种各样的问题。
[0003]如授权公告号为CN103232572B所公开的用于检测洛克沙胂的分子印迹聚合物及其制备方法，其虽然实现了分子印迹聚合物对洛克沙胂回收率为90％以上，对洛克沙胂显示高的交叉反应，具有高的选择性和特异性，作为分析饲料、动物组织及环境水等基质中洛克沙胂的样品净化前处理材料有着广泛的应用前景，但是并未解决现有洛克沙胂半抗原在制备生产的时候不能够快速的进行洛克沙胂半抗原的生成，使得抗体特异性较强，并且不能够实现对洛克沙胂半抗原的精准检测的问题，为此我们提出一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，以达到实现人工抗原制造、修饰改造的目的。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人
工抗原制备的方法，其特征在于：包括有以下步骤：
[0006]S1、选取实验耗材：4
‑
羟基苯胂酸，牛血清白蛋白、卵清白蛋白、弗氏佐剂、3，3'，5，5'
‑
四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、N，N
‑
二甲基甲酰胺、1
‑
乙基碳二亚胺、薄层硅胶板等；96孔可拆酶标板，其他化学制剂均为AR或GR；
[0007]S2、半抗原的改造，制备化合物A：将4
‑
羟基苯胂酸2.9
‑
3.4g溶于20mL蒸馏水中，加入KOH0.8
‑
1.2g，在95
‑
100℃的油浴的条件下搅拌1.5
‑
2.5h，加入氯乙酸1.7
‑
2.2mg，继续搅拌5
‑
8h，在室温条件下搅拌40
‑
50h，采用薄层色谱法跟踪反应进程，加0.8
‑
2mol/L的HCl调pH＝1.8
‑
2.4，静置析出固体，抽滤得化合物A；
[0008]S3、制备化合物B：称取化合物A溶于10mL浓硫酸中，加入0.09
‑
0.4gKNO3进行反应，采用薄层色谱法跟踪反应完成后，加蒸馏水静置待淡黄色固体析出，抽滤得化合物B，即改造半抗原；
[0009]S4、洛克沙胂人工抗原的合成:称取改造半抗原80.23
‑
85mg，分别加入2
‑
6mLDMF、120
‑
160mgEDC充分溶解，活化5
‑
7h，将40
‑
60mgBSA溶于少量PBS缓冲液中，加入420
‑
440μL活化液，2
‑
6℃低速搅拌过夜，用生理盐水透析纯化5d，换液13
‑
17次，即得洛克沙胂
‑
牛血清白蛋白，用作免疫原，以同种方法将BSA换成OA，即得洛克沙胂
‑
卵清蛋白，用作包被原；
[0010]S5、人工抗原鉴定与多克隆抗体制备：将BSA标准品、ROX
‑
BSA、OA、ROX
‑
OA经脱盐后分别与基质溶液混合，点到样品靶，置入质谱仪内进行激光扫描，确定人工抗原的偶联效果，半抗原与载体蛋白的偶联比按以下公式计算：C半抗原/C载体蛋白＝(MW人工抗原－MW载体蛋白)/MW半抗原；选取3只健康雌性新西兰大白兔接种ROX
‑
BSA，免疫前采血作为阴性对照，免疫剂量为1mg/只，免疫间隔周期为2周，共免疫7次，提取血清；
[0011]S6、间接ELISA方法的建立：采用方阵滴定法确定最适包被浓度、抗体稀释浓度，建立洛克沙胂间接竞争ELISA检测方法，将无竞争物时的D值作为B0值，各浓度抑制时的D值作为B值，以B/B0为纵坐标，各竞争物浓度的对数为横坐标，绘制竞争抑制曲线，将ROX标准品溶液换成系列浓度的2
‑
氨基苯胂酸、4
‑
羟基苯胂酸、AHPA、阿散酸、苯胂酸等5种竞争物，计算IC50和交叉反应率，评价方法的特异性，交叉反应率按以下公式计算:CR(％)＝IC50洛克沙胂/IC50各竞争物
×
100％。
[0012]优选的，所述S2中的蒸馏水通过Milli
‑
Q型超纯水仪进行净化制备，所述Milli
‑
Q型超纯水仪的参数是流量：0.8
‑
1.2LPM，过滤颗粒小于等于1/ml，微生物净化度小于等于1CFU/ml。
[0013]优选的，所述S2的搅拌过程采用的是90
‑
2型恒温磁力搅拌器，所述90
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：包括有以下步骤：S1、选取实验耗材：4
‑
羟基苯胂酸，牛血清白蛋白、卵清白蛋白、弗氏佐剂、3，3'，5，5'
‑
四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、N，N
‑
二甲基甲酰胺、1
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乙基碳二亚胺、薄层硅胶板等；96孔可拆酶标板，其他化学制剂均为AR或GR；S2、半抗原的改造，制备化合物A：将4
‑
羟基苯胂酸2.9
‑
3.4g溶于20mL蒸馏水中，加入KOH0.8
‑
1.2g，在95
‑
100℃的油浴的条件下搅拌1.5
‑
2.5h，加入氯乙酸1.7
‑
2.2mg，继续搅拌5
‑
8h，在室温条件下搅拌40
‑
50h，采用薄层色谱法跟踪反应进程，加0.8
‑
2mol/L的HCl调pH＝1.8
‑
2.4，静置析出固体，抽滤得化合物A；S3、制备化合物B：称取化合物A溶于10mL浓硫酸中，加入0.09
‑
0.4gKNO3进行反应，采用薄层色谱法跟踪反应完成后，加蒸馏水静置待淡黄色固体析出，抽滤得化合物B，即改造半抗原；S4、洛克沙胂人工抗原的合成：称取改造半抗原80.23
‑
85mg，分别加入2
‑
6mLDMF、120
‑
160mgEDC充分溶解，活化5
‑
7h，将40
‑
60mgBSA溶于少量PBS缓冲液中，加入420
‑
440μL活化液，2
‑
6℃低速搅拌过夜，用生理盐水透析纯化5d，换液13
‑
17次，即得洛克沙胂
‑
牛血清白蛋白，用作免疫原，以同种方法将BSA换成OA，即得洛克沙胂
‑
卵清蛋白，用作包被原；S5、人工抗原鉴定与多克隆抗体制备：将BSA标准品、ROX
‑
BSA、OA、ROX
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OA经脱盐后分别与基质溶液混合，点到样品靶，置入质谱仪内进行激光扫描，确定人工抗原的偶联效果，半抗原与载体蛋白的偶联比按以下公式计算：C半抗原/C载体蛋白＝(MW人工抗原－MW载体蛋白)/MW半抗原；选取3只健康雌性新西兰大白兔接种ROX
‑
BSA，免疫前采血作为阴性对照，免疫剂量为1mg/只，免疫间隔周期为2周，共免疫7次，提取血清；S6、间接ELISA方法的建立：采用方阵滴定法确定最适包被浓度、抗体稀释浓度，建立洛克沙胂间接竞争ELISA检测方法，将无竞争物时的D值作为B0值，各浓度抑制时的D值作为B值，以B/B0为纵坐标，各竞争物浓度的对数为横坐标，绘制竞争抑制曲线，将ROX标准品溶液换成系列浓度的2
‑
氨基苯胂酸、4
‑
羟基苯胂酸、AHPA、阿散酸、苯胂酸等5种竞争物，计算IC50和交叉反应率，评价方法的特异性，交叉反应率按以下公式计算:CR(％)＝IC50洛克沙胂/IC50各竞争物
×
100％。2.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S2中的蒸馏水通过Milli
‑
Q型超纯水仪进行净化制备，所述Milli
‑
Q型超纯水仪的参数是流量：0.8
‑
1.2LPM，过滤颗粒小于等于1/ml，微生物净化度小于等于1CFU/ml。3.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S2的搅拌过程采用...

【专利技术属性】
技术研发人员：常向彩，尹正军，刘琳琳，马明，方福平，周中艳，
申请(专利权)人：安顺学院，
类型：发明
国别省市：