一种诱导结肠癌高频转移的黑腹果蝇模型的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种诱导结肠癌高频转移的黑腹果蝇模型的建立方法，涉及生物遗传学技术领域；为了能够建立在成虫体内即可看到明显迁移，且迁移效率高、稳定的肿瘤迁移；本方法具体包括将lgl

【技术实现步骤摘要】
一种诱导结肠癌高频转移的黑腹果蝇模型的建立方法


[0001]本专利技术涉及生物遗传学
，尤其涉及一种诱导结肠癌高频转移的黑腹果蝇模型的建立方法。

技术介绍

[0002]MARCM(Mosaic analysis with a repressible maker,抑制细胞标记镶嵌分析)是一项结合FLP/FRT和UAS/Gal4/Gal80两种体系的一项用于研究果蝇遗传发育的技术工具，利用MARCM技术能够使其中UAS/Gal4系统在嵌合体中增加目的基因表达，实现在特定组织表达我们感兴趣的基因(可将其突变)，用FLP/FRT系统在在正常染色体上的一条臂上插入Gal80，使正常细胞无法表现荧光，而突变染色体通过同源重组，删除Gal80后发生Gal4和UAS结合，表达目的基因，得到所需的嵌合细胞，通过荧光显微镜镜下观察GFP阳性细胞，达到正向标记的目的。
[0003]果蝇作为肿瘤学研究有效的模型之一渐渐被人们发掘。果蝇因其遗传资源丰富，肿瘤发生相关信号通路高度保守，而且人类约75％致病基因在果蝇体内均有同源物。果蝇近年来也成为了研究肿瘤发生发展的重要模型。目前果蝇体内肿瘤迁移模型较少，大多以幼虫期成虫盘模型，在幼虫阶段进行筛选，受限于幼虫期时间短(幼虫期共约5天)，肿瘤转移急性，给药难等问题，不能有效模拟病人肿瘤转移的动态特征以及研究与机体衰老的关系。已有的果蝇成体肿瘤转移模型以结肠癌居多，但是转移效率非常低，并不适合药物筛选和机制研究。因此迫切需要建立在成虫体内即可看到明显迁移，且迁移效率高、稳定的肿瘤迁移。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种诱导结肠癌高频转移的黑腹果蝇模型的建立方法。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]一种诱导结肠癌高频转移的黑腹果蝇模型的建立方法，包括如下步骤：
[0007]S1：将lgl
‑
/
‑
UASRas
V12
，FRT40A/Cyo；TM3/TM6B果蝇品系和Sp/Cyo；UASRas
V12
，Sna
OE
/TM3/MKRS果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为lgl
‑
/
‑
UASRas
V12
，FRT40A/Cyo；UASRas
V12
，Sna
OE
/TM6B，建成可传代保存的果蝇品系；
[0008]S2：在果蝇库中挑选基因型为：hsflp；FRT40A，tubGal80/Cyo；tubGal4，UASGFP/TM6B的处女蝇与S1中选取的基因型为lgl
‑
/
‑
UASRRas
V12
，FRT40A/Cyo；UASRas
V12
，UASSna
OE
/TM6B的雄性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为hsflp；lgl
‑
/
‑
UASRas
V12
，FRT40A/FRT40A，tubGal80；UASRas
V12
，UASSna
OE
/tubGal4，UASGFP的雌性成虫，其外观表型为平翅，肩毛数目正常；
[0009]S3：将羽化后2
‑
3天的正确基因型果蝇在37℃水浴热激诱导1小时，后置于25℃恒温恒湿光照培养箱中培养3
‑
7天，头部或胸部具有GFP的果蝇即为诱导结肠癌高频转移的黑
腹果蝇模型。
[0010]优选的：所述S1中，lgl
‑
/
‑
UASRas
V12
，FRT40A/Cyo；TM3/TM6B果蝇品系和Sp/Cyo；UASRas
V12
，Sna
OE
/TM3/MKRS果蝇品系进行杂交时亲本雌雄任意组合均可。
[0011]进一步的：所述S3中，在热激诱导正确基因型果蝇形成肿瘤的1
‑
2天后，在荧光显微镜下GFP所标记的肿瘤细胞局限于腹部，诱导6
‑
8天后，20
‑
30％的目的基因型果蝇中GFP阳性的肿瘤细胞异位出现在胸腔及脑部区域。
[0012]进一步优选的：所述S3中，培养箱中培养的条件为：温度20
‑
30℃恒温，湿度50％
‑
60％；培养过程中所用的培养基的配方比为白糖100g：玉米粉320g：黄豆粉40g：红糖糖浆260g：琼脂40g：酵母粉72g：水5L。
[0013]作为本专利技术一种优选的：所述S3中，含有两个UASRas
V12
转基因，一个转录因子Sna(Snail)的过表达，以及一个lgl缺失突变，通过MARCM技术在小肠干细胞中进行诱导，促进肿瘤干细胞克隆性的生长和转移。
[0014]作为本专利技术进一步优选的：所述S2中，将果蝇在通有CO2的平板上麻醉后，再进行雌雄挑选、杂交和观察表型的操作。
[0015]作为本专利技术再进一步的方案：所述S2中，处女蝇选取方法为将原种瓶中的成虫全部清除，此后每隔8小时收集刚羽化的，表型身体细长而幼嫩得几乎透明的，同时能够看到腹腔内消化道的黑色食物残渣的雌性个体即为处女蝇。
[0016]在前述方案的基础上：所述S3中，将表现为无GFP的果蝇作为既不诱发肿瘤原位增殖也不引起转移的对照组；将表现为腹部有GFP，而头、胸部不存在GFP作为能够诱发原位肿瘤但未转移的对照组。
[0017]本专利技术的有益效果为：
[0018]1.肿瘤转移是癌症致死率居高不下的主要原因，对其机制的研究以及临床药物的研发受制于良好的肿瘤转移的动物模型，本专利技术以果蝇结肠癌为模型，通过遗传操纵Ras和lgl，Sna等肿瘤相关因子的表达，建立了一种简单、高效、经济的肿瘤转移模型，为肿瘤转移机制的相关研究及相关的药物筛选提供了全新的技术平台。
[0019]2.与哺乳动物肿瘤迁移模型相比，果蝇具有成本低，繁殖周期短，饲养简便的优势，可用于高通量药物筛选；果蝇体内MARCM体系对遗传研究方面具有优势，可用于检测基因组织特异性功能、决定基因功能所在位置、细胞谱系分析、使突变细胞和正常细胞相邻，更好的相互比较、对致死突变基因尤其重要、可以避开发育重要阶段从而研究其后期功能。
[0020]3.建立了高效的果蝇结肠癌转移模型，研究者可利用此模型肿瘤迁移的各项研究，包括分子机制，肿瘤微环境，免疫炎症，EMT(Epithelial to Mesenchymal Transition，上皮
‑
间充质转化过程)等，适用于高通量筛选，在哺乳动物细胞中对其同源物进行功能验证，以期为癌症的临床治疗提供新的药物靶点和治疗方案。
[0021]4.与现有的果蝇幼虫的体内肿瘤迁移模型相比，该模型用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导结肠癌高频转移的黑腹果蝇模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将lgl
‑
/
‑
UASRas
V12
，FRT40A/Cyo；TM3/TM6B果蝇品系和Sp/Cyo；UASRas
V12
，Sna
OE
/TM3/MKRS果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为lgl
‑
/
‑
UASRas
V12
，FRT40A/Cyo；UASRas
V12
，Sna
OE
/TM6B，建成可传代保存的果蝇品系；S2：在果蝇库中挑选基因型为：hsflp；FRT40A，tubGal80/Cyo；tubGal4，UASGFP/TM6B的处女蝇与S1中选取的基因型为lgl
‑
/
‑
UASRRas
V12
，FRT40A/Cyo；UASRas
V12
，UASSna
OE
/TM6B的雄性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为hsflp；lgl
‑
/
‑
UASRas
V12
，FRT40A/FRT40A，tubGal80；UASRas
V12
，UASSna
OE
/tubGal4，UASGFP的雌性成虫，其外观表型为平翅，肩毛数目正常；S3：将羽化后2
‑
3天的正确基因型果蝇在37℃水浴热激诱导1小时，后置于25℃恒温恒湿光照培养箱中培养3
‑
7天，头部或胸部具有GFP的果蝇即为诱导结肠癌高频转移的黑腹果蝇模型。2.根据权利要求1所述的一种诱导结肠癌高频转移的黑腹果蝇模型的建立方法，其特征在于，所述S1中，lgl
‑
/
‑
UASRas
V12
，FRT4...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈纾昕，孟天恺，邓寒松，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：