基于单细胞拉曼光谱快速预测食醋发酵进程的方法技术

本发明专利技术公开了基于单细胞拉曼光谱快速预测食醋发酵进程的方法，属于食醋酿造技术领域。本发明专利技术在对固态发酵食醋不同醋酸发酵阶段的微生物单细胞进行单细胞拉曼光谱的采集后，将醋醅样品的单细胞拉曼光谱数据进行层次聚类分析，按照距离将光谱数据分型，计算醋醅样品的微生物群落分型的组成，得到食醋固态发酵过程的微生物群落结构，并使用多元线性回归方法进行曲线拟合，得到预测发酵时间的模型。该模型可以用于预测新的样品来源的发酵池的发酵进程。本发明专利技术实现了在1h内快速检测食醋微生物群落结构的目标，具有指导食醋生产、为现代化智能酿醋设备的建立提供参考等极高的意义。化智能酿醋设备的建立提供参考等极高的意义。化智能酿醋设备的建立提供参考等极高的意义。

【技术实现步骤摘要】
基于单细胞拉曼光谱快速预测食醋发酵进程的方法


[0001]本专利技术涉及基于单细胞拉曼光谱快速预测食醋发酵进程的方法，属于食醋酿造


技术介绍

[0002]固态的开放式天然发酵是我国酿醋的主要方式。在醋醅这样一个微生物群落环境中，由复杂的生理生化和物理化学反应，包括微生物之间的相互作用，来生成醋酸和其他的主体风味物质。固态发酵食醋是指以大米、糯米或高粱等粮食谷物等为主要原料酿醋，再辅以麸皮、稻壳等填充剂为辅料，以固态方式在开放式环境下经多菌种协同参与醋酸发酵酿造而成的食醋。固态发酵食醋仅存在于中国，如中国东部地区的镇江香醋、中国西部地区的四川麸醋、中国华北的山西老陈醋和天津独流醋以及中国西北地区的凉州熏醋等。酿醋原料的复杂性和环境的开放性造就了酿醋微生物群落的多样性和复杂性，酿醋微生物群落的多样性和复杂性又赋予食醋丰富的口感和协调的香，生产出酸味柔和、醋香浓郁、酯香突出的食醋。
[0003]固态发酵食醋的酿造主要包括两个过程：酒精发酵和醋酸发酵。酒精发酵阶段包括淀粉质原料的糊化、糖化和酒化，主要是通过霉菌和酵母菌等所产生的糖化酶、淀粉酶以及酒化酶系共同催化完成；而在醋酸发酵阶段主要是通过醋酸菌、乳酸菌等微生物将乙醇氧化为醋酸，这些微生物除了产生乙酸还能产生大量的风味物质，赋予食醋丰富的口感和协调的香。
[0004]通常，固态发酵食醋产品的质量在很大程度上取决于对发酵进程的准确监控并在适当的时间终止发酵。目前，监控发酵进程的方法主要是对pH值、可滴定酸度、总酸含量等进行检测监控。但，这种方法具有滞后性。因为，正是微生物群落的活动导致了发酵体系的上述各项理化指标的变化。当依赖理化指标去调控发酵条件或终止发酵，往往难以获得符合预期品质的食醋产品。因此，有必要寻找一种能够从源头上对最终产品质量有影响的指标进行实时监测。酿造固态发酵食醋的核心为稳定的微生物群落，主要包括乳酸菌、醋酸菌等。群落中的微生物在发酵过程中多具有独特的功能，通过代谢过程产生风味物质和功能因子，形成食醋的风味骨架，进而影响食醋的最终品质。
[0005]目前，固态发酵食醋酿醋微生物群落的检测以高通量测序技术为主，但是应用高通量测序技术检测醋酸发酵进程的微生物群落变化存在耗时长等问题，无法及时辅助生产的研判，导致了生产过程中对酿醋微生物群落的了解有一定的滞后性；且环境、季节、工人的操作等因素都会影响固态发酵食醋酿醋微生物群落结构。因此，如何快速的检测固态发酵食醋醋酸发酵阶段的微生物群落变化，预测食醋固态发酵进程是目前亟待解决的问题。
[0006]拉曼光谱(Raman spectra)，是一种散射光谱。拉曼光谱分析法是基于拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。拉曼光谱检测作为一种快速、无损、无标记、非接触的快速检测技术，已被应用于各行各业中。特别是在生命科学领域，由于拉曼光谱分析时样品的用量
很少，不需要对生物样品进行脱水、包埋、切片、染色、标记等繁琐的前处理程序，不仅操作简单，而且不会损伤样品从而能够获得样品最真实的信息。另外，生物大分子多是处在水溶液环境中，水的拉曼散射很弱，干扰小，而且单细胞拉曼光谱能提供细胞内核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物含量等大量信息，可在不损伤细胞的条件下实时动态地监测细胞分子结构变化，可以对细胞、病毒等进行原位检测分析，表征微生物细胞的基因型、表型和生理状态。
[0007]目前，拉曼光谱已被应用于探究微生物单细胞对物质吸收后特征峰的变化、推导物质循环过程、进行微生物分类鉴定和探索基因型与表型的关系。但，食醋固态发酵过程具有微生物群落结构复杂、酿造周期长、无法实时检测等特殊性，应用拉曼光谱还存在无法原位检测、部分微生物的拉曼光谱信噪比较低等问题。

技术实现思路

[0008][技术问题][0009]本专利技术要解决的技术问题是现有食醋固态发酵进程部分理化指标或高通量测序来判断，存在滞后性、成本高的问题。
[0010][技术方案][0011]针对现有技术存在的问题与不足，本专利技术提供了一种基于单细胞拉曼光谱快速预测食醋固态发酵进程的方法及应用，在对固态发酵食醋不同醋酸发酵阶段的微生物单细胞进行单细胞拉曼光谱的采集后，建立固态发酵食醋酿造过程中基于单细胞拉曼光谱的微生物群落的数据模型，基于此数据模型预测新的醋醅的理论发酵时间。所述理论发酵时间不同于实际的发酵时间，而是根据微生物群落信息预测的发酵时间。实际的发酵时间是从接种种醅开始计时的，理论发酵时间通常比实际的发酵时间短，在某些情况下，也可能比实际的发酵时间长，这主要取决于微生物群落的生长代谢情况。
[0012]作为本专利技术的一个方面，提供基于单细胞拉曼光谱的分析食醋固态发酵过程的微生物群落结构的方法，包括以下步骤：
[0013](1)醋醅样品的采集：采集不同发酵时间的醋醅样品1～5g；
[0014](2)醋醅样品的预处理：取步骤(1)中的醋醅样品，加入4～20mL无菌ddH2O振荡1～3min后静置30s～1min，吸取1～4mL菌悬液用无菌水洗涤1～3次后重悬获得醋醅微生物群落的菌悬液；
[0015](3)醋醅样品的单细胞拉曼光谱数据采集：吸取步骤(2)中的菌悬液进行单细胞拉曼光谱的采集，其中光谱采集条件为：使用532nm激光，采集范围为280
‑
3800cm
‑1，激光强度为6mW，采集时间为5～20s/次，累积次数1～3次，不同发酵时间的醋醅分别采集100～500个细胞；
[0016](4)单细胞拉曼光谱数据的预处理：所有测得的醋醅样品的单细胞拉曼光谱数据均需要进行宇宙射线的消除、背景噪音的去除、对基线进行校正处理、并对所有的数据进行归一化处理，设置最大峰为100；
[0017](5)醋醅样品的单细胞拉曼光谱数据分型划分：汇总所有发酵时间下的醋醅样品的单细胞拉曼光谱数据进行层次聚类分析，按照距离将光谱数据分型，计算在不同发酵时间下的醋醅样品的微生物群落分型的组成，得到食醋固态发酵全过程的微生物群落结构。
[0018]作为本专利技术的另一个方面，提供基于单细胞拉曼光谱的用于快速预测食醋固态发
酵进程的模型的构建方法，包括以下步骤：
[0019](1)醋醅样品的采集：
[0020]采集不同发酵时间的醋醅样品1～5g；
[0021](2)醋醅样品的预处理：
[0022]取步骤(1)中的醋醅样品，加入4～20mL无菌ddH2O振荡1～3min后静置30s～1min，吸取1～4mL菌悬液用无菌水洗涤1～3次后重悬获得醋醅微生物群落的菌悬液；
[0023](3)醋醅样品的单细胞拉曼光谱数据采集：
[0024]吸取步骤(2)中的菌悬液进行单细胞拉曼光谱的采集，其中光谱采集条件为：使用532nm激光，采集范围为280
‑
3800cm
‑1，激光强度为6mW，采集时间为5～20s/次，累积次数1～3次，不同发酵时间的醋醅分别采集1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分析食醋固态发酵过程的微生物群落结构的方法，其特征在于，是将醋醅样品的单细胞拉曼光谱数据进行层次聚类分析，按照距离将光谱数据分型，计算醋醅样品的微生物群落分型的组成，得到食醋固态发酵过程的微生物群落结构。2.根据权利要求1所述的分析食醋固态发酵过程的微生物群落结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)醋醅样品的采集：采集不同发酵时间的醋醅样品；(2)醋醅样品的预处理：取步骤(1)中的醋醅样品，加入无菌水振荡、静置，吸取菌悬液用无菌水洗涤后重悬，获得醋醅微生物群落的菌悬液；(3)醋醅样品的单细胞拉曼光谱数据采集：吸取步骤(2)中的菌悬液进行单细胞拉曼光谱的采集，其中，光谱采集条件为：使用532nm激光，采集范围为280
‑
3800cm
‑1，激光强度为6mW，采集时间为5～20s/次，累积次数1～3次，不同发酵时间的醋醅分别采集100～500个细胞；(4)单细胞拉曼光谱数据的预处理：所有测得的醋醅样品的单细胞拉曼光谱数据均需要进行宇宙射线的消除、背景噪音的去除、对基线进行校正处理、并对所有的数据进行归一化处理，设置最大峰为100；(5)醋醅样品的单细胞拉曼光谱数据分型划分：汇总所有发酵时间下的醋醅样品的单细胞拉曼光谱数据进行层次聚类分析，按照距离将光谱数据分型，计算在不同发酵时间下的醋醅样品的微生物群落分型的组成，得到食醋固态发酵全过程的微生物群落结构。3.基于单细胞拉曼光谱的用于快速预测食醋固态发酵进程的模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集醋醅样品，(2)醋醅样品的预处理：取步骤(1)中的醋醅样品，加入无菌水振荡后静置，吸取菌悬液用无菌水洗涤后，重悬获得醋醅微生物群落的菌悬液；(3)醋醅样品的单细胞拉曼光谱数据采集：吸取步骤(2)中的菌悬液进行单细胞拉曼光谱的采集，其中光谱采集条件为：使用532nm激光，采集范围为280
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3800cm
‑1，激光强度为6mW，采集时间为5～20s/次，累积次数1～3次，不同发酵时间的醋醅分别采集100～500个细胞；(4)单细胞拉曼光谱数据的预...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆震鸣，许正宏，杨婷，徐蕾，史劲松，张晓娟，柴丽娟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：