一种用于检测人HLA-B*15：02基因突变的引物探针组合及其试剂盒，以及方法技术

本发明专利技术提供一种用于检测人HLA

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测人HLA
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B*15：02基因突变的引物探针组合及其试剂盒，以及方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，更具体地涉及一种用于检测人HLA
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B*15： 02基因突变的特异性引物探针组合及其试剂盒，以及方法。

技术介绍

[0002]癫痫是由多种病因引起的一种慢性脑部疾病，主要特点是由于大脑神经元反复、过度的同步化放电并导致发作性、突然性、短暂性的脑功能紊乱，同时伴有临床各型癫痫发作和脑电图痫性波及其他的异常改变。卡马西平(CBZ)、拉莫三嗪(LTG)、奥卡西平(OXC)、苯妥英钠(PHT)以及妥泰 (PB)都具有相似的芳香族结构，是广泛使用的用于控制癫痫、三叉神经痛等的抗癫痫药物(AEDs)。然而，该类药物通常会导致皮肤不良反应(cADRs)，因此长期困扰着临床医生。cADRs占所有报道的药物不良反应的10％
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30％，包括轻度的斑丘疹(MPE)、药物超敏反应综合症(HSS)到重型的有潜在致命性的Stevens
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Johnson综合症(SJS)和/或中毒性表皮坏死松解症 (Toxicepidermal necrolysis，TEN)。
[0003]根据2004年发表于自然期刊的文献，HLA
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B*15:02基因突变被发现对于部分地区人群因使用卡马西平诱发的史蒂芬琼森症候群(Stevens
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JohnsonSyndrome，SJS)以及毒性上皮溶解(Toxic Epidermal Necrolysis，TEN)呈强相关性。后来这一结果又在多地人群中得到确认。在此期间，研究结果显示在整个汉族人群中，HLA
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B*15:02基因均与卡马西平诱发的SJS/TEN存在强烈关联性。美国FDA强烈建议亚洲族裔人群在服用卡马西平前进行 HLA
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B*15:02突变的基因检测。研究发现，中国南部和中部人群中 HLA
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B*15:02的发生频率分别是11％和8％左右。由于SJS的致死率在5％，而TEN的致死率在30％左右，所以一旦患者服用卡马西平诱发SJS/TEN，可能导致很严重的后果，并可能造成不可挽回的损失。已有研究表明，通过筛查HLA
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B*15:02基因突变，并且按照检测结果干预治疗方案可以降低患者服用卡马西平所致SJS/TEN的风险。
[0004]目前常见的用于检测HLA
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B15：02基因突变方法有PCR
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sanger测序法、 qPCR法，以及二代测序法、PCR电泳法等。其中，PCR
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sanger测序法的优点是结果准确，但是其缺点是过程繁琐，操作复杂，并且耗时长，通量低。二代测序法与sanger测序法优缺点相似，同时结果准确，但是操作复杂，耗时长，同时测序成本也很高。PCR电泳法等操作繁琐，耗时较长。qPCR的方法是常用的检测HLA
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B15：02基因突变的方法。
[0005]目前市面上用于检测HLA
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B*15：02基因突变的qPCR试剂盒中，包括：采用染料法的试剂盒，以及采用探针法的试剂盒。总的来说，探针法的灵敏度较高，对模板需求量比较少，而染料法如果不使用溶解曲线解析，则无法做到多个靶标同时扩增，如果使用溶解曲线解析，那耗时将比探针法长。qPCR 试剂盒有采用一套PCR引物探针进行HLA
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B*15：02基因突变鉴定的，也有采用两套或者三套PCR引物探针进行鉴定的。在中国地区，一套与两套或者三套的检测结果相差不大，准确率相差不到1％。但总体说来，这些试剂盒或多或少存在耗时较长以及出现假阳性的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种用于检测人HLA
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B*15：02基因突变的特异性引物探针组合及其试剂盒，以及方法，从而解决现有技术中针对人HLA
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B*15： 02基因突变检测的方法及试剂盒存在过程繁琐、操作复杂、耗时长、成本高的问题。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]根据本专利技术的第一方面，提供一种用于检测人HLA
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B*15：02基因突变的特异性引物探针组合，包括以下引物和探针序列：针对人HLA
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B*15：02 基因的上游引物Fp1：5'
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GCGAGTCCGAGGATGGCGCCC
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3'；针对人HLA
‑ꢀ
B*15：02基因的下游引物Rp1：5'
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TTGTAGTAGCCGCGCAGGTTC
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3'；识别人HLA
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B*15：02基因突变的探针probe1：5'
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FAM
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AACACACAGATCTCCA AGACCAACACACAG
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BHQ1
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3'；针对内参基因人RPPH基因片段的上游引物 Fp2：5'
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CCGCCTCTGGCCCTAGT
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3'；针对内参基因人RPPH基因片段的下游引物Rp2：5'
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GCCACGAGCTGAGTGCGT
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3'；识别内参基因人RPPH基因片段保守序列特异性的探针probe2：5'
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VIC
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TGTCACTCCACTCCCATGTCCCT TGG
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BHQ1
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3'。
[0009]根据本专利技术的第二方面，提供一种用于检测人HLA
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B*15：02基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括如上面所述的用于检测人HLA
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B*15：02基因突变的特异性引物探针组合。
[0010]所述试剂盒还包括反应液、阳性对照和阴性对照；其中，所述反应液的成分包括：Tris缓冲液，MgCl2，dNTP，引物，探针，Taq酶，UDG酶，PCR 增强剂，水；所述阳性对照为含有HLA
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B*15：02基因型部分序列和Control 基因部分序列的质粒，所述阴性对照为含有HLA
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B*15：11基因型部分序列和Control基因部分序列的质粒。应当理解的是，阳性对照和阴性对照的设计为本领域技术人员的常规技术手段，此处不做赘述。
[0011]根据本专利技术的第三方面，还提供一种用于检测人HLA
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B*15：02基因突变的TaqMan探针实时荧光PCR方法，用于非疾病诊断目的，包括以下步骤： 1)针对人HLA
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B*15：02基因以及内参基因人RPPH基因的序列特点，设计出如上面所述的特异性引物探针组合；2)获得抽提的待测样本基因组DNA； 3)在同一个反应体系中，将上述引物探针组合按照一定比例混合，加入反应液中；4)进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测人HLA
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B*15：02基因突变的特异性引物探针组合，其特征在于，包括以下引物和探针序列：针对人HLA
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B*15：02基因的上游引物Fp1：5'
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GCGAGTCCGAGGATGGCGCCC
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3'；针对人HLA
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B*15：02基因的下游引物Rp1：5'
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TTGTAGTAGCCGCGCAGGTTC
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3'；识别人HLA
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B*15：02基因突变的探针probe1：5'
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FAM
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AACACACAGATCTCCAAGACCAACACACAG
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BHQ1
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3'；针对内参基因人RPPH基因片段的上游引物Fp2：5'
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CCGCCTCTGGCCCTAGT
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3'；针对内参基因人RPPH基因片段的下游引物Rp2：5'
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GCCACGAGCTGAGTGCGT
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3'；以及识别内参基因人RPPH基因片段保守序列特异性的探针probe2：5'
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VIC
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TGTCACTCCACTCCCATGTCCCTTGG
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BHQ1
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3'。2.一种用于检测人HLA
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B*15：02基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括根据权利要求1所述的用于检测人HLA
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B*15：02基因突变的特异性引物探针组合。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液、阳性对照和阴性对照；其中，所述反应液的成分包括：Tris缓冲液，MgCl2，dNTP，引物，探针，Taq酶，UDG酶，PCR增强剂，水；所述阳性对照为含有HLA
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【专利技术属性】
技术研发人员：何熲，张辉，蒋天宇，巩许婷，韦鑫，
申请(专利权)人：上海康黎诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：