一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法技术

一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法，将探针结合锁核酸LNA修饰，以提高Tm1与Tm2的差异，所述Tm1为探针与完全匹配的序列结合时的Tm值，所述Tm2为探针与单核苷酸变异序列匹配的Tm值，将修饰后的探针对单核苷酸变异的位点进行区分和定量。本发明专利技术对探针中的核苷酸进行了LNA锁核酸修饰，提高了Tm1与Tm2间的温度差异，所以提升了探针对单核苷酸变异序列的区分能力，可以检测到更低突变含量的模板。可以检测到更低突变含量的模板。可以检测到更低突变含量的模板。

【技术实现步骤摘要】
一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法。

技术介绍

[0002]单核苷酸变异的识别在用药监控等方面有重要意义。如特定的基因突变是肿瘤靶向治疗的重要生物标记物，基因突变检测可在疾病进展前尽早发现耐药突变，帮助医生制定临床治疗决策，为患者争取治疗时机。
[0003]目前单核苷酸变异的检测主要用实时荧光定量PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)平台。实时荧光定量PCR平台是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测定每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。其结果以扩增曲线的形式呈现，结果以Ct值表示，其检测灵敏度高，在结合Taqman荧光探针的使用后，可以特异性地表征待测基因的扩增情况。
[0004]现有检测和定量单核苷酸变异的技术是等位基因特异性扩增法(amplification refractory mutation system，ARMS)。ARMS
‑
PCR的基本原理为：如果引物的3
′
端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3
′
端碱基分别与突变和无突变的模板碱基互补，从而将有特定点突变的模板与无突变的模板区分开来。
[0005]目前ARMS技术具有以下缺点：1、ARMS技术受限于引物末端的序列，设计局限性较大；2、ARMS引物需要严格控制反应液配比与反应温度才能达到所需检测要求，重现性较差；3、ARMS引物的特异性有限，特异性指耐受的非检测核苷酸位点的浓度，可耐受的浓度越高，可以检测到的突变占比约低，越有利于低突变含量样本的准确检出。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法，与现有技术相比，本专利技术在准确性和敏感性与其相当，在特异性、反应程序耐受度和重现性方面会更优。
[0007]为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法，将探针结合锁核酸LNA(locked nucleic acid)修饰，以提高Tm1与Tm2的差异，所述Tm1为探针与完全匹配的序列结合时的Tm(melting temperature熔解温度)值，所述Tm2为探针与单核苷酸变异序列匹配的Tm值，将修饰后的探针对单核苷酸变异的位点进行区分和定量。
[0009]本专利技术中，检测序列为COSV61615239(c.395G>A)，即待测核酸片段1在395位点的核苷酸为G，而待测核酸片段2在395位点的核苷酸为A，片段1与片段2在395位点之外的序列是一样的。
[0010]如图1所示，本专利技术中，引物为IDH1
‑
F和IDH1
‑
R；探针为突变型探针IDH1
‑
MT
‑
P和野生型探针IDH1
‑
WT
‑
P；引物IDH1
‑
F与IDH1
‑
R可对片段1与片段2扩增，突变型探针IDH1
‑
MT
‑
P
和野生型探针IDH1
‑
WT
‑
P可分别与片段1和片段2特异结合，IDH1
‑
MT
‑
P和IDH1
‑
WT
‑
P的5
’
与3
’
分别带有荧光基团与淬灭基团，所以探针在反应中不能扩增，当所述探针与其模板特异结合时可检测相应片段的有无。
[0011]不同DNA寡核苷酸链之间的结合力不同，寡核苷酸链之间的结合力越强，双链的热稳定性越高，从而双链的Tm值越高。将探针与完全匹配的序列结合时的Tm值，记为Tm1，探针与单核苷酸变异序列匹配的Tm值，记为Tm2。理论上，将退火温度设置于Tm2与Tm1之间，且Tm1高于退火温度在3℃以上，退火温度高于Tm2在3℃以上时，可以保证探针极大部分与完全匹配的模板序列相结合，而不与或极少与单核苷酸变异序列相结合。这需要Tm1与Tm2的差异足够大(约6℃及以上)，常规设计的探针，对于单核苷酸变异的位点，Tm1与Tm2的差异一般在4℃左右。本专利技术中，将探针结合锁核酸LNA修饰，提高了Tm1与Tm2的差异，修饰后的探针可以达到上述的理论要求，所以本专利技术中仅依靠探针即可对单核苷酸变异的位点进行区分和定量。
[0012]相对于现有技术，本专利技术技术方案取得的有益效果是：
[0013]本专利技术利用LNA修饰的探针对单核苷酸变异位点实现识别与定量检测，相较现有技术，本专利技术具有更优的性能，可以达到更优的特异性和反应程序兼容性，极大限度地解决了现有技术的缺点。
[0014]本专利技术中，片段1和片段2在实际应用场景中会同时存在，需要通过检测手段得到片段1和片段2的混合物中两者的相对含量，尤其需要对极微量含量的模板得到有效定值，现有方法的单核苷酸变异序列的区分能力有赖于引物(即ARMS方法)，本专利技术的单核苷酸变异序列的区分能力有赖于探针，与现有方法相比有更优的定值能力。
[0015]本专利技术对探针中的核苷酸进行了LNA锁核酸修饰，提高了Tm1与Tm2间的温度差异，所以提升了探针对单核苷酸变异序列的区分能力，可以检测到更低突变含量的模板。
附图说明
[0016]图1为本专利技术片段1和片段2与引物、探针的作用示意图；
[0017]图2为突变型标准品的检测结果；
[0018]图3为突变型标准品的标准曲线；
[0019]图4为野生型标准品的检测结果；
[0020]图5为野生型标准品的标准曲线；
[0021]图6为突变型检测体系在退火温度60℃下的检测结果；
[0022]图7为突变型检测体系在退火温度57℃下的检测结果；
[0023]图8为突变型ARMS
‑
PCR体系在退火温度60℃下的检测结果；
[0024]图9为突变型ARMS
‑
PCR体系在退火温度57℃下的检测结果；
[0025]图10为各突变含量的模拟阳性样本的检测结果；
[0026]图11为已知阴性结果的突变型体系样本的检测结果；
[0027]图12为已知阴性结果的野生型体系样本的检测结果。
具体实施方式
[0028]为了使本专利技术所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结
合附图和实施例，对本专利技术做进一步详细说明。
[0029]一、引物和探针的设计
[0030]检测序列见COSMIC数据库(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)中的序列号COSV61615239。用Primer Premier5.0软件设计引物和探针。用Tm Uti本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法，其特征在于：将探针结合锁核酸LNA修饰，以提高Tm1与Tm2的差异，所述Tm1为探针与完全匹配的序列结合时的Tm值，所述Tm2为探针与单核苷酸变异序列匹配的Tm值，将修饰后的探针对单核苷酸变异的位点进行区分和定量。2.如权利要求1所述的一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法，其特征在于：检测序列为COSV61615239(c.395G>A)，即待测核酸片段1在395位点的核苷酸为G，而待测核酸片段2在395位点的核苷酸为A，片段1与片段2在395位点之外的序列是一样的。3.如权利要求2所述的一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法，其特征在于：引物为IDH1
‑
F和IDH1
‑
R；探针为突变型探针IDH1
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪润芳，郭婷婷，赵菁，康金妹，李官林，
申请(专利权)人：厦门致善生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：