一种荧光定量PCR反应系统、PCR反应试剂盒及核酸定量检测方法技术方案

本申请公开了一种荧光定量PCR反应系统、试剂盒及核酸定量检测方法，所述荧光定量PCR反应系统利用核酸内切酶特异性地产生一段Flap序列，所述Flap序列可作为一段核苷酸序列扩增时的引物，而该核苷酸序列上存在多个的发光探针结合区段，因此，当该核苷酸序列扩增时，发光探针被DNA聚合酶切割而产生荧光信号。由于该核苷酸序列上结合有多个发光探针，且Flap序列的数量与待荧光定量PCR检测的目标基因的数量相关，所以所述荧光定量PCR反应系统可实现对目标基因的特异性扩增，且信号强度大大提升，从而提高了对临界样本的检测灵敏度。从而提高了对临界样本的检测灵敏度。从而提高了对临界样本的检测灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种荧光定量PCR反应系统、PCR反应试剂盒及核酸定量检测方法


[0001]本专利技术涉及荧光定量PCR
，尤其涉及一种荧光定量PCR反应系统、PCR反应试剂盒及核酸定量检测方法。

技术介绍

[0002]实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技术是指：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积而达到实时监测整个PCR进程的目的，并可结合相应的软件对产物进行定量分析，获得起始模板的初始浓度。实时荧光定量PCR技术极大地简化了定量检测的过程，真正实现了绝对定量，可应用于疾病诊断、食品安全检测、科学研究等领域，具有广泛的应用前景。
[0003]实时荧光定量PCR技术是利用荧光信号达到阈值时所需的循环数(CT值)来推算原始模板量。目前，按照荧光信号的产生原理分类，实时荧光定量PCR技术具有非特异性荧光报告系统和特异性荧光报告系统两大类，其中，非特异性荧光报告系统的代表是SYBR Green染料法，特异性荧光报告系统的代表是TaqMan探针法。SYBR Green染料法是在常规PCR反应体系中加入SYBR Green染料分子，其与双链DNA分子结合，并在497nm波长下激发产生荧光，但是SYBR Green染料分子与双链DNA分子的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，染料分子除了与特异性的靶序列扩增产物结合外，还可与在PCR扩增过程中产生的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，即：SYBR Green染料分子可与任意一个双链DNA分子相结合，因此，采用该方法不易区分非特异性扩增，扩增效率较低，从而较大程度影响检测结果的准确性。
[0004]TaqMan探针法，是在常规PCR反应体系中加入了具有荧光标记的TaqMan探针，TaqMan探针的5
′
端标记有报告基团，3
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端标记有淬灭基团。TaqMan探针完整时，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，无荧光信号产生；随着PCR反应的进行，通过DNA链的延伸，Taq酶遇到与模板DNA结合的TaqMan探针，在Taq酶的3
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端至5
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端的外切核酸酶活性下，TaqMan探针被切断，使得报告基团和淬灭基团分离，从而产生荧光信号产生。由于TaqMan探针的核苷酸序列是依据待扩增的靶序列设计而成，所以TaqMan探针只能与待检测序列相结合，与SYBR Green染料法相比，提高了检测的特异性和结果的准确性，但是该方法是对于每一种模板DNA，都需要针对性地设计特异性探针，具有较高的实验成本；并且由于检测仪器具有检测下限，当模板DNA的含量较少时，易发生无荧光信号值，或者多次检测中CT值不稳定的状况，导致出现检测结果不易判读的问题。也就是说，现有的TaqMan探针法具有临界样本检测灵敏度低的缺陷。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种荧光定量PCR反应系统、试剂盒及核酸定量检测方法，以改善现有TaqMan探针法荧光定量PCR中存在的实验成本高、临界样本检测灵敏度低的问题。
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种荧光定量PCR反应系统，包括：核酸内切酶、上游探针、下游探针、发光探针、第一核苷酸序列以及模板，所述下游探针包括相连的第二核苷酸序列和第三核苷酸序列；所述模板上具有与所述上游探针相互补结合的第一区段，且所述模板上具有与所述第二核苷酸序列互补结合的第二区段，且所述模板上不具有与所述第三核苷酸序列相结合的区段；所述第一区段和所述第二区段之间具有一个碱基的重叠；所述第一核苷酸序列以及所述第一核苷酸序列的互补序列中的至少一者上，具有多个所述发光探针的结合区段和至少一个所述第三核苷酸序列的结合区段；所述下游探针与所述模板结合时，所述核酸内切酶可以从所述重叠的碱基处进行切割释放所述第三核苷酸序列。
[0007]进一步的，所述第三核苷酸序列是用于扩增所述第一核苷酸序列的正向引物。
[0008]进一步的，所述核酸内切酶为Flap核酸内切酶1(Flap endonuclease 1,FEN1)，对应地，所述第三核苷酸序列为Flap序列。本专利技术所述的FEN1是一种具有结构特异性的多功能核酸酶，具有5
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端至3
′
端的Flap核酸内切酶(FEN)活力。所述FEN1在细胞内作用于冈崎片段成熟、长片段碱基切除修复和维持端粒的稳定性等多条DNA代谢途径。与其他大多识别特定核苷酸序列的限制性内切酶不同，所述FEN1是通过识别特定的DNA结构来识别DNA底物，而非通过识别特定核苷酸序列来识别DNA底物。
[0009]进一步的，所述发光探针为TaqMan探针，且所述发光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]进一步的，所述第一核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]进一步的，所述荧光定量PCR反应系统还包括：缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、参比基因以及用于扩增模板的正向引物和逆向引物。
[0012]进一步的，所述上游探针的核苷酸序列与用于扩增模板的正向引物相同；或者，所述上游探针的核苷酸序列与用于扩增模板的逆向引物相同。
[0013]本领域技术人员可以理解，所述荧光定量PCR反应系统还可以包括PCR反应所必须的其他试剂，例如：双蒸水等。
[0014]第二方面，本专利技术提供了一种PCR反应试剂盒，包括：核酸内切酶、上游探针、下游探针、发光探针以及第一核苷酸序列，其中，
[0015]所述上游探针是与PCR反应的模板的第一区段相互补结合的核苷酸序列；
[0016]所述下游探针包括相连的第二核苷酸序列和第三核苷酸序列，并且所述第二核苷酸序列与所述模板的第二区段相互补结合，所述第三核苷酸序列不能与所述模板的任何区段相结合；
[0017]所述第一区段和所述第二区段之间具有一个重叠的碱基；
[0018]所述第一核苷酸序列以及所述第一核苷酸序列的互补序列中的至少一者上，具有多个所述发光探针的结合区段和至少一个所述第三核苷酸序列的结合区段。
[0019]进一步的，所述第三核苷酸序列是用于扩增所述第一核苷酸序列的正向引物，所述核酸内切酶为Flap核酸内切酶1，对应地，所述第三核苷酸序列为Flap序列。
[0020]本领域技术人员可以理解，所述PCR反应试剂盒还可以包括PCR反应所必须的其他试剂，例如：脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液、DNA聚合酶、参比基因以及双蒸水等。
[0021]第三方面，本专利技术提供了一种核酸定量检测方法，是采用第一方面中所述的荧光定量PCR反应系统进行荧光定量PCR检测，或者是采用第二方面中所述的PCR反应试剂盒进
行荧光定量PCR检测。
[0022]本专利技术还提供了所述荧光定量PCR反应系统或所述PCR反应试剂盒的应用，可应用于本领域各种核酸/DNA分子的定量和/或非定量检测。对本专利技术中所述荧光定量PCR反应系统或所述PCR反应试剂盒能够检测的核酸/DNA分子不作特别的限定，可以用于非诊本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光定量PCR反应系统，其特征在于，包括：核酸内切酶、上游探针、下游探针、发光探针、第一核苷酸序列以及模板，所述下游探针包括相连的第二核苷酸序列和第三核苷酸序列；所述模板上具有与所述上游探针相互补结合的第一区段，且所述模板上具有与所述第二核苷酸序列互补结合的第二区段，且所述模板上不具有与所述第三核苷酸序列相结合的区段；所述第一区段和所述第二区段之间具有一个重叠的碱基；所述第一核苷酸序列以及所述第一核苷酸序列的互补序列中的至少一者上，具有多个所述发光探针的结合区段和至少一个所述第三核苷酸序列的结合区段；所述下游探针与所述模板结合时，所述核酸内切酶可以从所述重叠的碱基处进行切割释放所述第三核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述第三核苷酸序列是用于扩增所述第一核苷酸序列的正向引物。3.根据权利要求1或2所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述核酸内切酶为Flap核酸内切酶1，对应地，所述第三核苷酸序列为Flap序列。4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述发光探针为TaqMan探针，且所述发光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述第一核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。6.根据权利要求1所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：张良禄，李婷婷，董兰兰，
申请(专利权)人：武汉艾米森生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：