一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂及方法技术

本发明专利技术涉及一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂及方法，包括分别由核苷酸衍生出的四种均具有碱基互补配对能力的核苷酸衍生物，四种化合物的核苷酸3

【技术实现步骤摘要】
一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂及方法


[0001]本专利技术涉及涉及核酸测序领域，尤其是一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂及方法。

技术介绍

[0002]基因测序技术是基因组学乃至生命科学研究的关键和基本技术之一，也是基本生物信息数据主要获取手段，是推动生物计算和生物信息学发展的原动力。自Sangger测序方法诞生以来，测序技术极大推动生命科学和医学的发展。最近十几年来，高通量的第二代DNA测序技术的成功应用再次推动了医学生命科学领域的飞速发展，并催生了“精准医疗”的产生。精准医疗是个系统工程，大数据是基础，基因测序是工具，只有软硬件有机结合，才可能实现技术上的精准医疗。但现有的基因测序中，测试成本高，测试装置复杂，需要多种激发光源，而且测试的质量和准确性不高。

技术实现思路

[0003]针对现有的不足，本专利技术提供一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂及方法。
[0004]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂：包括化合1、化合物2、化合物3和化合物4；所述化合1、化合物2、化合物3和化合物4是分别由核苷酸A、(T/U)、C和G衍生出的四种不同的均具有碱基互补配对能力的核苷酸衍生物，四种化合物的核苷酸3
′
位置处的羟基均被保护基团保护，且保护基团能够断裂重新将3
′
位置处的羟基裸露出来，其中：
[0005]化合物1是能发出荧光信号的携带有荧光基团的核苷酸衍生物；
[0006]化合物2是不能发岀荧光信号的但携带有能发生连接反应的可反应性基团的核苷酸衍生物，所述可反应性基团能与可反应性荧光基团发生连接反应后能够发岀与化合物1相同的荧光信号；或者化合物2是能够发岀与化合物1相同的荧光信号，但携带有与化合物1不同的能断裂移除的可断裂链荧光基团的核苷酸衍生物，所述可断裂链荧光基团的断裂移除对化合物1没有影响；
[0007]化合物3是携带有pH值敏感荧光基团的核苷酸衍生物，其在pH值大于7.5时不能发岀荧光信号或发出的荧光信号与化合物1发出的荧光信号不同，而在pH值小于6.8时能发出和化合物1和化合物2相同的荧光信号，所述pH值敏感荧光基团的结构与化合物1中的荧光基团的结构不同；
[0008]化合物4是不能发岀荧光信号不带有荧光基团的核苷酸衍生物。
[0009]作为优选，所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4是各自独立地具有式(I)或式(II)的化合物，
[0010][0011]其中；B代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C、G中任意一种；
[0012]R1各自独立地选自氢、单磷酸基团、二磷酸基团、三磷酸基团、四磷酸基团；
[0013]R2各自独立地为能够进行正交切割反应的可反应性基团；
[0014]R3各自独立地选自-H或-OH；
[0015]R4各自独立地为能够进行正交切割反应的可反应性基团；
[0016]L1,L2各自独立地为连接基团或不存在；
[0017]R5各自独立地为能够发岀荧光信号的pH值敏感荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应性基团。
[0018]作为优选，所述pH值敏感荧光基团是包括如下任意一种结构式的化合物：
[0019][0020]其中：X为卤素，各自独立地选自氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)；
[0021]R6各自独立地选自氢、C1-C10饱和烷基、C1-C10饱和烷基链羧基、C1-C10饱和烷基链炔基、C1-C10烷基链氨基、C1-C10烷基链叠氮基、C1-C10烷基链巯基、C1-C10烷基链马来酰亚胺、C1-C10烷基链磺酸基、聚乙二醇羧基、聚乙二醇链炔基、聚乙二醇链氨基、聚乙二醇叠氮、聚乙二醇巯基、聚乙二醇马来酰亚胺；
[0022]R7各自独立地选自氢，C1-C6饱和烷基；
[0023]环A和环B各自独立地选自具有式(
Ⅵ
)，(
Ⅶ
)，(
Ⅷ
)，(
Ⅸ
)的杂环基团，
[0024][0025]其中；R8，R9和R12各自独立地选自氢、C1-C10饱和烷基、C1-C10饱和烷基链羧基、C1-C10饱和烷基链炔基、C1-C10烷基链氨基、C1-C10烷基链叠氮基、C1-C10烷基链巯基、C1-C10烷基链马来酰亚胺、C1-C10烷基链磺酸基、聚乙二醇羧基、聚乙二醇链炔基、聚乙二醇链氨基、聚乙二醇叠氮、聚乙二醇巯基、聚乙二醇马来酰亚胺；
[0026]R10和R11各自独立地选自氢，磺酸基。
[0027]作为优选，所述荧光基团是CY3、CY5、CY5.5、AF488、ATTO 495、ATTO532、AF532、AF568、ROX、R6G、ATTO700、AF700、AF680、AF660、ATTO680、ATTO655、AF647、ATTO647N、AF633、ATTO594、ATTO Rho101、ATTO 590、Quasar670、AF 594、ATTO Thio12、AF 555、FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、TAMRA、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Fluor Red635、CY7、IF700、Quasar705中的任意一种荧光标记物。
[0028]作为优选，所述可反应性基团是如下结构中的任意一种：
[0029]叠氮基团马来酰亚胺环炔基环炔基环烯基生物素
[0030]苯基硼酸地高辛；
[0031]所述可反应性荧光基团是携带有荧光基团的与可反应性基团形成互补的互补基团，其与可反应性基团能进行正交连接反应，是如下结构中的任意一种：
[0032]叠氮基团巯基环炔基环炔基四嗪基水杨基异羟脂酸基、链霉亲和素、地高辛抗体。
[0033]作为优选，所述可断裂链荧光基团是指响应于外部刺激而可切割的，并且通过切割将碱基和荧光基团或可反应性基团分离为不同实体的二价部分或一价部分的链基团。
[0034]作为优选，所述可断裂链荧光基团是如下结构中的任意一种：
[0035]叠氮链基团双硫链基团
[0036]烯丙基链基团
[0037]二烷基缩酮链基团
[0038]偶氮链基团
[0039]氰乙基链基团
[0040]1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环已-1-基)乙基链基团硝基苄基链基团
[0041]作为优选，所述保护基团是能终止聚合酶的聚合作用并可被切割去除的基团，所述保护基团使得在聚合反应中有且只有一个碱基被并入生长的核酸链，且保护基团被去除后使得核苷酸衍生物3
′
位置处的羟基转变为游离的羟基，并能进行再次的引入一个碱基的聚合反应。
[0042]一种基于pH值敏感染料的基因测序方法，步骤如下：
[0043]S1，将待测序的核酸、核酸聚合酶、引物、权力本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂，其特征在于：包括化合物1、化合物2、化合物3和化合物4；所述化合物1、化合物2、化合物3和化合物4是分别由核苷酸A、(T/U)、C和G衍生出的四种不同的均具有碱基互补配对能力的核苷酸衍生物，四种化合物的核苷酸3
′
位置处的羟基均被保护基团保护，且保护基团能够断裂重新将3
′
位置处的羟基裸露出来，其中：化合物1是能发出荧光信号的携带有荧光基团的核苷酸衍生物；化合物2是不能发岀荧光信号的但携带有能发生连接反应的可反应性基团的核苷酸衍生物，所述可反应性基团能与可反应性荧光基团发生连接反应后能够发岀与化合物1相同的荧光信号；或者化合物2是能够发岀与化合物1相同的荧光信号，但携带有与化合物1不同的能断裂移除的可断裂链荧光基团的核苷酸衍生物，所述可断裂链荧光基团的断裂移除对化合物1没有影响；化合物3是携带有pH值敏感荧光基团的核苷酸衍生物，其在pH值大于7.5时不能发岀荧光信号或发出的荧光信号与化合物1发出的荧光信号不同，而在pH值小于6.8时能发出和化合物1和化合物2相同的荧光信号，所述pH值敏感荧光基团的结构与化合物1中的荧光基团的结构不同；化合物4是不能发岀荧光信号不带有荧光基团的核苷酸衍生物。2.根据权利要求1所述基于pH值敏感染料的基因测序试剂，其特征在于：所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4是各自独立地具有式(I)或式(II)的化合物，其中；B代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C、G中任意一种；R1各自独立地选自氢、单磷酸基团、二磷酸基团、三磷酸基团、四磷酸基团；R2各自独立地为能够进行正交切割反应的可反应性基团；R3各自独立地选自-H或-OH；R4各自独立地为能够进行正交切割反应的可反应性基团；L1,L2各自独立地为连接基团或不存在；R5各自独立地为能够发岀荧光信号的pH值敏感荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应性基团。3.根据权利要求1所述基于pH值敏感染料的基因测序试剂，其特征在于：所述pH值敏感荧光基团是包括如下任意一种结构式的化合物：
560、TAMRA、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Fluor Red635、CY7、IF700、Quasar705中的任意一种荧光标记物。5.根据权利要求1所述基于pH值敏感染料的基因测序试剂，其特征在于：所述可反应性基团是如下结构中的任意一种：叠氮基团马来酰亚胺环炔基环炔基环烯基生物素苯基硼酸地高辛；所述可反应性荧光基团是携带有荧光基团的与可反应性基团形成互补的互补基团，其与可反应性基团能进行正交连接反应，是如下结构中的任意一种：叠氮基团巯基环炔基
四嗪基水杨基异羟脂酸基、链霉亲和素、地高辛抗体。6.根据权利要求1所述基于pH值敏感染...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈鑫，杨超，卓少春，刘婷，冯越，伍建，
申请(专利权)人：深圳铭毅基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：