一种养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂制造技术

本发明专利技术公开一种养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂，是由沼泽红假单胞菌、丁酸梭菌、柞树叶提取物及芦荟叶提取物混合为饲料添加剂，每克饲料中的添加量为沼泽红假单胞菌105~10

【技术实现步骤摘要】
一种养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂


[0001]本专利技术属于微生物工程技术和棘皮动物病害防治领域，尤其涉及一种养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂。

技术介绍

[0002]刺参（Apostichopus japonicus）属于棘皮动物门、海参纲，富含蛋白质、矿物质、维生素等多种天然活性物质，具有极高的滋补和药用价值，目前刺参养殖业已快速发展。“腐皮综合征”是刺参养殖过程中的常见疾病，具有暴发性强、感染速度快、死亡率高等特点。研究发现，灿烂弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等致病性弧菌是引起刺参“腐皮综合征”的主要病原菌。由于食品安全、环境保护和抗药性等问题，用于抑制致病性弧菌的抗生素类药物正逐渐被水产养殖业所摈弃。因此，亟需开发绿色无公害的抗生素替代物来抑制致病性弧菌，以提高刺参的免疫机能及抗病能力。
[0003]沼泽红假单胞菌含有丰富的蛋白质、维生素、微量元素及生理活性物质，能够降解水体中的亚硝酸盐、硫化物等有毒物质，同时释放具有抗病力的酵素，不但能促进有益微生物的增殖，还能抑制许多致病菌的滋生。丁酸梭菌是一类具有内生芽孢结构的厌氧杆菌，是调节肠道微生态平衡的有益菌，其主要代谢产物丁酸是肠道细胞再生和修复的主要营养物质，在肠道内可以阻止致病菌的入侵和定植，纠正肠道菌群紊乱，调整宿主体内的微生态平衡。同时，丁酸梭菌在肠道内可产生维生素、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等物质，对机体具有良好的营养和保健作用。柞树叶和芦荟叶具有天然、营养、毒副作用小等特点。同时，柞树叶和芦荟叶也具有良好的体外抑菌能力，不仅对病原微生物有抑制作用，还可以有效提升机体的抗应激能力和抗病修复能力。
[0004]然而，迄今为止并没有关于将沼泽红假单胞菌、丁酸梭菌、柞树叶和芦荟叶合理配伍以提高生物效价的养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂的相关报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂。
[0006]本专利技术的技术解决方案是：一种养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂，其特征在于是由沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、柞树叶提取物及芦荟叶提取物混合为饲料添加剂，每克饲料中的添加量为沼泽红假单胞菌105~10
7 cfu、丁酸梭菌105~10
7 cfu、柞树叶提取物1~2 mg、芦荟叶提取物4~8 mg；所述柞树叶提取物和芦荟叶提取物按照如下方法制备：分别将柞树叶与芦荟叶用蒸馏水清洗干净，25 ℃通风阴干；用匀浆机分别将柞树叶与芦荟叶匀浆粉碎，加入体积分数为65~85%的乙醇溶液，料液比为0.05~0.1 g/mL；在工作频率为40 KHZ，功率为80 W的超声波作用下常温浸提1~2.5 h；将浸提液装入超滤膜装置内，在0.06 Mpa压力条件下过滤去掉杂质，经减压浓缩、冷冻干燥得到冻干粉，即柞树叶提取物和芦荟叶提取物。
[0007]最佳技术方案是每克饲料中添加沼泽红假单胞菌10
6 cfu、丁酸梭菌10
6 cfu、柞树叶提取物1.5 mg、芦荟叶提取物6 mg。
[0008]所述沼泽红假单胞菌按照如下步骤制备而成：步骤1：将0.1 g活菌数为0.5
×
10
10
~10
10 cfu/g的沼泽红假单胞菌冻干粉菌剂充分溶解于1 ml无菌蒸馏水中，将菌种在固体培养基上划线活化，所述固体培养基组分为胰蛋白胨15.0 g/L，大豆胨5.0 g/L，氯化钠5.0 g/L及琼脂20 g/L，pH7.5~8.0；在光照度为2000~3000 lux，温度为30~35 ℃的条件下于厌氧培养箱中培养至平板出现红色单菌落；步骤2：挑取红色单菌落接种于沼泽红假单胞菌液体培养基中，培养温度为30~35℃，光照强度为2000~3000 lux，于厌氧培养箱中静置培养3~5天，所述液体培养基组分为胰蛋白胨15.0 g/L，大豆胨5.0 g/L及氯化钠5.0 g/L， pH7.5~8.0；步骤3：于6000 rpm离心10 min，收集菌体，用无菌海水重悬菌体。
[0009]所述固体培养基和液体培养基中还添加有如下组分：氯化镁0.1~0.3 g/L，硫酸亚铁2~5 mg/L，硫酸锌0.5~1.5 mg/L，氯化锰0.1~0.3 mg/L，氯化镍1~4 mg/L及吲哚乙酸0.3~0.8 mg/L。
[0010]所述丁酸梭菌按照如下步骤制备而成：步骤1：将0.1 g活菌数0.5
×
10
10
~10
10 cfu/g的丁酸梭菌冻干粉菌剂充分溶解于1 ml无菌蒸馏水中，将菌种在强化梭菌琼脂培养基上划线活化，厌氧培养箱37 ℃培养至平板出现圆形单菌落；所述强化梭菌琼脂培养基组分为蛋白胨10 g/L，牛肉粉10 g/L，酵母粉3 g/L，葡萄糖5 g/L，可溶性淀粉1 g/L，氯化钠5 g/L，醋酸钠3 g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L，硫酸锰 0.15 g/L，磷酸氢二钾1.5 g/L，0.25 g/L氯化钙，硫酸镁 0.65 g/L及琼脂15 g/L，pH6.8~7.2；步骤2：挑取单菌落，接种于强化梭菌液体培养基中，静置于厌氧培养箱中37 ℃厌氧培养1~2天；所述强化梭菌液体培养基组分为蛋白胨10 g/L，牛肉粉10 g/L，酵母粉3 g/L，葡萄糖5 g/L，可溶性淀粉1 g/L，氯化钠5 g/L，醋酸钠3 g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L，硫酸锰 0.15 g/L，磷酸氢二钾1.5 g/L，0.25 g/L氯化钙及硫酸镁 0.65 g/L，pH6.8~7.2；步骤3：于6000 rpm离心10 min，收集菌体，用无菌海水重悬菌体。
[0011]本专利技术首次将沼泽红假单胞菌、丁酸梭菌、柞树叶提取物和芦荟叶提取物科学配伍制成复合微生态制剂并应用于刺参养殖。沼泽红假单胞菌和丁酸梭菌均属于兼性厌氧菌种，不仅可有效避免菌种之间的相互拮抗作用，反而丁酸梭菌在代谢过程中产生的丁酸可中和碱性物质，作为沼泽红假单胞菌生长的碳源，促进沼泽红假单胞菌的生长，同时沼泽红假单胞菌和丁酸梭菌可促进刺参对柞树叶提取物和芦荟叶提取物的吸收和利用；柞树叶提取物和芦荟叶提取物的有效成分可以抑制丁酸梭菌和沼泽红假单胞菌中的杂菌且可为二者的生长提供碳源，既可提高丁酸梭菌和沼泽红假单胞菌存活率，又可促进丁酸梭菌的丁酸转化率。本专利技术各个组分的合理配伍可以形成联动效应，不仅可以增加刺参养殖水体含氧量，而且可以使单组分的免疫刺激作用得以提升且靶向性更明显，既能够显著增强刺参机体的免疫应答，更能作用于特定免疫细胞，从而有选择性地诱导机体形成针对特异性抗原的有效免疫应答，增强刺参的非特异性免疫机能和抗病能力，有效抑制致病性弧菌的滋生，具有较高的生物效价。本专利技术在保证无污染、无残留、无抗药性、无毒副作用的前提下，对提升刺参养殖效果、增加经济效益具有重要意义。
ml无菌蒸馏水中，将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂，其特征在于是由沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、柞树叶提取物及芦荟叶提取物混合为饲料添加剂，每克饲料中的添加量为沼泽红假单胞菌105~10
7 cfu、丁酸梭菌105~10
7 cfu、柞树叶提取物1~2 mg、芦荟叶提取物4~8 mg；所述柞树叶提取物和芦荟叶提取物按照如下方法制备：分别将柞树叶与芦荟叶用蒸馏水清洗干净，25 ℃通风阴干；用匀浆机分别将柞树叶与芦荟叶匀浆粉碎，加入体积分数为65~85%的乙醇溶液，料液比为0.05~0.1 g/mL；在工作频率为40 KHZ，功率为80 W的超声波作用下常温浸提1~2.5 h；将浸提液装入超滤膜装置内，在0.06 Mpa压力条件下过滤去掉杂质，经减压浓缩、冷冻干燥得到冻干粉，即柞树叶提取物和芦荟叶提取物。2. 根据权利要求1所述的养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂，其特征在于每克饲料中添加沼泽红假单胞菌10
6 cfu、丁酸梭菌10
6 cfu、柞树叶提取物1.5 mg、芦荟叶提取物6 mg。3.根据权利要求1或2所述的养殖刺参用抑制致病弧菌的复合微生态制剂，其特征在于所述沼泽红假单胞菌按照如下步骤制备而成：步骤1：将0.1 g活菌数为0.5
×
10
10
~10
10 cfu/g的沼泽红假单胞菌冻干粉菌剂溶解于1 ml无菌蒸馏水中，将菌种在固体培养基上划线活化，所述固体培养基组分为胰蛋白胨15.0 g/L，大豆胨5.0 g/L，氯化钠5.0 g/L及琼脂20 g/L，pH7.5~8.0；在光照度为2000~3000 lux，温度为30~35 ℃的条件下于厌氧培养箱中培养至平板出现红色单菌落；步骤2：挑取红色单菌落接种于沼泽红假单胞菌液体培养基中，培养温度为30~35 ℃，光照强度为2000~3000...

【专利技术属性】
技术研发人员：王旭达，蒋经伟，李石磊，周遵春，叶博，关晓燕，董颖，赵泽龙，米锐，王摆，高杉，王晓燕，
申请(专利权)人：辽宁省海洋水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：