一种检测甲状腺过氧化物酶抗体及其亚型的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测甲状腺过氧化物酶抗体及其亚型的试剂盒，属于生物医药技术领域。所述试剂盒包括：

【技术实现步骤摘要】
一种检测甲状腺过氧化物酶抗体及其亚型的试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种检测甲状腺过氧化物酶抗体及其亚型的试剂盒。

技术介绍

[0002]甲状腺过氧化物酶(TPO)是分子量约为103kD、结合血红素的膜蛋白质，定位于甲状腺滤泡上皮顶端细胞膜上，是催化甲状腺激素合成的关键酶。甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)是自身免疫性甲状腺疾病重要的自身抗原靶标之一，可通过抗体和补体依赖细胞介导的细胞毒作用导致甲状腺细胞破坏，是桥本甲状腺炎的标志性抗体，但血清TPOAb浓度相同的不同患者甲状腺损伤程度及进展不同，仅检测TPOAb滴度很难评估病情严重程度。TPOAb主要为免疫球蛋白G(immunoglobμLin G，IgG)类抗体，研究发现TPOAb IgG亚型在不同的甲状腺疾病中分布不同，且高滴度IgG1亚型预示进展为甲减可能。然而，不同桥本甲状腺炎患者TPOAb IgG亚型具体分布如何及这种亚型分布与桥本甲状腺炎的病理生理过程及甲状腺功能损伤的进展具有怎样的联系，目前国内外相关报道较少，因此其相关检测尚未纳入临床常规检测，相关的检测试剂盒也未上市。
[0003]目前对于抗TPO抗体IgG亚型的研究仍不太多，检测方法主要为酶联免疫分析(ELISA)。ELISA法操作简单、检测时间短且无辐射污染，但是酶免疫使用的介质有毒或会致癌，灵敏度、重复性和特异性较差，线性范围窄，不易实现全自动化等方法学限制因素；同时目前有关该方法测定甲状腺自身抗体的亚类分布的报道结果存在一些相互矛盾。放射配体检测法是利用放射性核素标记的配体与相应的受体进行特异结合反应，从而对受体进行定性和定量检测的分析法；该方法有灵敏度高、特异性强、精密度和准确度高以及应用广泛等特点，是疾病诊断和医学研究的重要方法，迄今已可用本技术测定体内各种微量生物活性物质，如激素、蛋白质、抗体、免疫球蛋白、微生素和药物。
[0004]因此，有必要开发出高性能的放射配体检测试剂盒检测TPOAb IgG总量及其亚型。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种检测甲状腺过氧化物酶抗体及其亚型的试剂盒。
[0006]本专利技术在现有的放射配体检测法基础上，结合上下游的原理将核心步骤进行替换，首次引入链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂和生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体，为抗体亚型的分型重新打造了核心的技术平台，随后利用生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体与甲状腺过氧化物酶抗体的亚型结合，从而实现对甲状腺过氧化物酶抗体亚型的检测，成功实现技术平台的升级以及甲状腺过氧化物酶抗体亚型检测技术的突破。
[0007]具体地：本专利技术所述检测甲状腺过氧化物酶抗体及其亚型的试剂盒，包括：
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I标记的人甲状腺过氧化物酶，链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂，生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体，蛋白A琼脂糖，蛋白G琼脂糖，TBST缓冲液和牛血清白蛋白；所述生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体包括鼠抗人IgG1、鼠抗人IgG2、兔抗人IgG3和鼠抗人IgG4。
[0008]采用上述试剂盒检测甲状腺过氧化物酶抗体及其亚型的方法，包括以下步骤：
[0009]步骤一，甲状腺过氧化物酶抗体的检测：
[0010]先将
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I标记的人甲状腺过氧化物酶与待测血清置于加样平板中孵育，再取抗原缓冲液加至PVDF微孔板中进行孵育，弃去PVDF微孔板的孵育液，向PVDF微孔板中加入蛋白A琼脂糖和蛋白G琼脂糖，然后加入加样平板中的混合液，形成抗原
‑
抗体复合物的沉淀，去除PVDF微孔板的上清液，用TBST缓冲液洗涤沉淀，之后加入闪烁液置Counter计数仪上计数，得到TGAb总IgG指数；
[0011]步骤二，甲状腺过氧化物酶抗体亚型的检测：
[0012]先将
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I标记的人甲状腺过氧化物酶与待测血清置于加样平板中孵育，再取生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体与链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂进行孵育形成抗体
‑
琼脂糖复合物；之后取抗原缓冲液加至PVDF微孔板中进行孵育，弃去PVDF微孔板的孵育液，向其中加入抗体
‑
琼脂糖复合物，然后加入加样平板中的混合液，形成抗原
‑
抗体复合物的沉淀，去除PVDF微孔板的上清液，用TBST缓冲液洗涤沉淀，之后加入闪烁液置Counter计数仪上计数。
[0013]上述过程中，抗原缓冲液是TBST缓冲液加牛血清白蛋白制成。
[0014]本专利技术的试剂盒可用于检测甲状腺过氧化物酶抗体及其亚型，灵敏度高、特异性强。
附图说明
[0015]图1为放射配体检测法检测TPOAb的线性范围。
[0016]图2为TPOAb IgG亚型在桥本甲状腺炎中的分布结果。
具体实施方式
[0017]目前对于抗TPO抗体IgG亚型的研究仍不太多，检测方法主要为酶联免疫分析(ELISA)。ELISA法操作简单、检测时间短且无辐射污染，但是酶免疫使用的介质有毒或会致癌，灵敏度、重复性和特异性较差，线性范围窄，不易实现全自动化等方法学限制因素；同时目前有关该方法测定甲状腺自身抗体的亚类分布的报道结果存在一些相互矛盾。
[0018]专利技术人实验室现有的放射配体法检测糖尿病自身抗体技术处于国际先进水平，本专利技术在本实验室现有的放射配体检测法基础上，结合上下游的原理将核心步骤进行替换，首次引入链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂和生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体，为抗体亚型的分型重新打造了核心的技术平台，随后利用生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体与甲状腺过氧化物酶抗体的亚型结合，从而实现对甲状腺过氧化物酶抗体亚型的检测，成功实现技术平台的升级以及甲状腺过氧化物酶抗体亚型检测技术的突破。
[0019]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
[0020]在本专利技术中，所采用的样本、试剂及仪器如下：
[0021]1、对象：收集2019年11月至2021年3月在南京医科大学附属第一医院确诊的84例桥本甲状腺炎患者血清。分析前均储存于
‑
80℃。
[0022]2、材料：(1)质控血清来源：阳性质控血清标本为含高滴度TPOAb(>600IU/mL)的临床血清，阴性质控血清标本取自于无自身免疫甲状腺炎家族史的健康志愿者。(2)试剂：
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I标记的人甲状腺过氧化物酶(
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I
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TPO，北京北方生物技术研究所)，链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂(StSa 17
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5113
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01，GE Healthcare)，生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体(MoAb：鼠抗人IgG1，ab99775，Abcam本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测甲状腺过氧化物酶抗体及其亚型的试剂盒，其特征在于：包括：
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I标记的人甲状腺过氧化物酶，链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂，生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体，蛋白A琼脂糖，蛋白G琼脂糖；所述生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体包括鼠...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑旭琴，赵成程，崔岱，李璐阳，顾愹，付煜，陈恒，杨涛，
申请(专利权)人：江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：