一种猪产毒多杀性巴氏杆菌的保护性抗原蛋白及其应用、疫苗制造技术

本发明专利技术涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种猪产毒多杀性巴氏杆菌的保护性抗原蛋白及其应用、疫苗。该保护性抗原蛋白为PMT蛋白N端第1～520的多肽片段。实验表明，该保护性抗原蛋白具有较高的免疫原性，能有效预防和/或治疗猪萎缩性鼻炎。本发明专利技术还提供了表达所述抗原蛋白的大肠杆菌表达系统PET

【技术实现步骤摘要】
一种猪产毒多杀性巴氏杆菌的保护性抗原蛋白及其应用、疫苗


[0001]本专利技术涉及免疫学
，尤其涉及一种猪产毒多杀性巴氏杆菌的保护性抗原蛋白及其应用、疫苗。

技术介绍

[0002]猪萎缩性鼻炎(atrophic rhinitis，AR)是一类慢性呼吸道疾病，以鼻腔广泛扩张和黏膜、黏膜下层及骨组织萎缩为主要特征，具高度接触传染性，可使猪群抵抗力下降、面部变形、生长速度迟缓、料肉比增大、投入成本升高，增加种猪淘汰率，严重的会继发感染引起支原体、脑膜炎或猪生殖
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呼吸道综合症等多种疾病，给生猪养殖业带来较大的经济损失。
[0003]根据病原及发病特点，可将该病分为非进行性萎缩性鼻炎(Non
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progressive atrophic rhinitis，NPAR)和进行性萎缩鼻炎(Progressive atrophic rhinitis，PAR)。非进行性萎缩性鼻炎主要由支气管败血波氏杆菌引起，Bb是革兰氏阴性菌，致病毒素是皮肤坏死毒素(Dermonecrotic toxin，DNT)，是引发萎缩性鼻炎的重要因素，但不是唯一因素。单一的支气管败血波氏杆菌感染发病不严重，鼻骨的缺陷可再生。
[0004]进行性萎缩性鼻炎主要由产毒素多杀巴氏杆菌引起，产毒素多杀巴氏杆菌具有各种毒力因子，包括毒素、粘附素和菌毛。鼻粘膜受损后容易继发D型产毒素型多杀性巴氏杆菌的感染，感染的D型产毒素型多杀性巴氏杆菌分泌的多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin，PMT)进入细胞可刺激上呼吸道间质组织细胞不断增生。PMT毒素能够诱导细胞的合成，促进骨细胞的生长和分裂，一方面，由于破骨细胞大量增殖，导致鼻甲骨被吸收，另一方面，由于格根包尔氏细胞作用受到抑制而停止鼻甲骨的再生，从而导致鼻甲骨形态及生长异常。
[0005]随着国内抗生素禁用制度越来越严格，人们对猪萎缩性鼻炎致病机理有了深入了解后，开始重视AR疫苗对AR控制的有效性。目前，市面上用于预防和控制的商品化疫苗主要有灭活苗、类毒素苗、亚单位疫苗。虽然类毒素苗免疫效果优于灭活苗，但是菌体天然分泌的PMT量非常有限，人工表达效率低成本高，且纯化工艺复杂，存在难以规模化生产的问题，且现有的亚单位疫苗中目的蛋白多为包涵体表达，包涵体蛋白无生物活性且复性工艺操作复杂，或目的蛋白在上清中的可溶表达量较低，菌体沉淀中的目的蛋白不通过复性工艺纯化直接丢弃造成浪费，大大增大了上下游生产的成本。
[0006]CN105797152A一种疫苗组合物及其制备方法和应用中介绍了一种将PRN
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N、PRN
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C、PMT
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N和PMT
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C 4种蛋白组合在一起的亚单位疫苗，也是通过构建重组的大肠杆菌菌株，分别表达上述4种蛋白，并将蛋白混合灭活后制备上述亚单位疫苗，具有较好的免疫保护效果。该方法需要构建4种重组菌种，并进行4条线放大生产分别表达4种蛋白，再将4种亚单位蛋白不经纯化直接混合60℃灭活后组合为一种疫苗，疫苗中内毒素含量较高，影响疫苗安全性，不经纯化的疫苗中杂蛋白过多容易引起猪群应激，且操作较为繁琐，大大增加了产线
的生产成本，并且，以上4种蛋白表达量为212
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563μg/ml，蛋白表达量不够理想，生产产能较低不利于放大生产。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种高安全性、高免疫原性PMT
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N蛋白。
[0008]本专利技术的第二个目是提供一种高产可溶性PMT
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N蛋白的重组菌株。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种治疗和/或防治猪萎缩性鼻炎的亚单位疫苗。
[0010]本专利技术通过以下技术方案实现：
[0011]一种猪产毒多杀性巴氏杆菌的保护性抗原蛋白，其为PMTN
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端蛋白，其氨基酸序列如SED ID NO：1所示。
[0012]作为优选，其由蛋白表达系统共表达获得；在本专利技术的一些具体实施例中，所述蛋白表达系统为大肠杆菌表达系统。
[0013]本专利技术还提供了所述的保护性抗原蛋白的制备方法，将编码PMT N
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端蛋白的核酸分子与表达载体连接构建重组表达载体，将重组表达载体转化到大肠杆菌中，培养，诱导表达，获得所述保护性抗原蛋白。
[0014]本专利技术还提供了编码本专利技术所述的保护性抗原蛋白的核酸分子。
[0015]本专利技术还提供了包含所述核酸分子的生物材料，其中，所述生物材料为表达载体或宿主菌或宿主细胞。
[0016]作为优选，所述生物材料为表达载体，所述表达载体的骨架为PET系列载体。
[0017]作为优选，所述生物材料为宿主菌；所述宿主菌为大肠杆菌；在一些优选的实施方案中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21；在一些具体实施例中，本专利技术构建的包含所述PMT
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N端蛋白的生物材料为PET
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PMT
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N重组菌。
[0018]本专利技术通过实验验证了本专利技术构建的PET
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PMT
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N重组菌表达的PMT
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N端蛋白可达到95％可溶，免去了包涵体蛋白纯化及复性的难题，将PMT
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N可纯化得到目的蛋白产量提高至0.4
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0.8mg/ml，大大提高了生产产能，且动物实验证明蛋白免疫原性较好，安全性高，无需灭活，操作简单，利于生产放大。
[0019]本专利技术还提供了以上所述的保护性抗原蛋白、所述的核酸分子或所述的生物材料在制备猪萎缩性鼻炎疫苗中的应用。
[0020]本专利技术还提供一种治疗和/或防治猪萎缩性鼻炎的亚单位疫苗，包括本专利技术所述的保护性抗原蛋白和疫苗佐剂。
[0021]本专利技术通过将所述PMT
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N蛋白与PET系列载体连接，转化大肠杆菌，通过免疫原性对比及PET系列载体筛选，获得的重组菌株PET29b
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PMT
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N，可将目的蛋白可溶性提升至95％，从而将PMT
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N目的蛋白可溶产量提高至0.4
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0.8mg/ml，免去了包涵体蛋白纯化及复性的难题，并通过效力试验验证了PMT
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N蛋白具有良好的免疫原性，增大了其生产实用性。
[0022]本专利技术的构建了一系列的包含不同PMT
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N端蛋白的重组菌，最终获得了免疫原性较高的SED ID NO：1所示的PMT
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N端蛋白。本专利技术进一步将该蛋白与不同的PET系列载体通过酶切酶连构建重组质粒，诱导表达并纯化出目的蛋白，以此筛选出可溶表达量最高的重组PET29b
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PMT
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N菌株，并通过大量的生物学数据证明由本专利技术制备的PMT
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N蛋白可用于制
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪产毒多杀性巴氏杆菌的保护性抗原蛋白，其特征在于，其为PMT N
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端蛋白，其氨基酸序列如SED ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的保护性抗原蛋白，其由蛋白表达系统共表达获得。3.根据权利要求5所述的保护性抗原蛋白，其特征在于，所述蛋白表达系统为大肠杆菌表达系统。4.权利要求1所述的保护性抗原蛋白的制备方法，其特征在于，将编码PMTN
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端蛋白的核酸分子与表达载体连接构建重组表达载体，将重组表达载体转化到大肠杆菌中，培养，诱导表达，获得所述保护性抗原蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛旻，杨瑞华，李国强，鲁璐，肖红照，姚菓，贾宾，程帅，
申请(专利权)人：河南兴华生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：