可共价交联CD25的白细胞介素-2及其在自身免疫病治疗中的应用制造技术

本发明专利技术涉及可使人白细胞介素

【技术实现步骤摘要】
可共价交联CD25的白细胞介素
‑
2及其在自身免疫病治疗中的应用


[0001]本专利技术属于生物制药领域，具体涉及定点插入非天然氨基酸的白细胞介素
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2,使其可以在接触CD25受体后，与其产生共价交联，从而具有特异性激活调节T细胞的作用。本专利技术进一步涉及上述定点修饰的白介素
‑
2在治疗自身免疫病的用途，如作为安全、有效的系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、移植物抗宿主排斥反应病等的用途。

技术介绍

[0002]白细胞介素
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2(interleukin
‑
2)是一种多效性细胞因子，同时具有激活调节T细胞(Treg)和效应细胞的活性，是免疫调控重要的细胞因子之一。IL
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2通过与细胞膜上的IL
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2受体(IL
‑
2R)结合发挥生物作用，IL
‑
2R是由α、β、γ三分子亚基组成，其中α链(CD25)不具备信号传递功能，仅能与β和γ链一起，作为三分子复合物与IL
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2形成高亲和力结合(Kd＝10pM)；而β链(CD122)和γ(CD132)链都属于I型细胞因子受体超家族，两者可以在缺失α链的前提下，与IL
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2形成中亲和力结合(Kd＝1nM，进而传导下游信号(R.Spolski et al.,2018).三种受体亚基在不同的细胞亚群中表达量各不相同，CD25在调节T细胞(Treg)表面持续长效表达；自然杀伤细胞(NK)和CD8+T杀伤细胞则在一般状态下低表达CD25而常规表达IL
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2Rβ和γ。因此Treg细胞在机体无外来抗原刺激情况下，对IL
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2的敏感性大于NK，CD8+T等效应细胞(Boyman et al.,2006).已有的研究表明，低剂量IL
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2通过偏向性激活Treg细胞，抑制自身免疫，起到治疗自身免疫病的效果。然而，由于高剂量的IL
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2可以激活免疫，因此低剂量IL
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2疗法有着加重免疫病的风险。如何使IL
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2偏向性激活Treg细胞，是此领域关键的科学问题之一。
[0003]已有的研究表明，IL
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2在结合IL
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2Rαβγ三受体复合物后，会快速进行内吞，并在初级内体中进行分离。其中，IL
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2Rβγ会进入次级内体和溶酶体，进而被降解；而IL
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2Rα(CD25)会在初级内体中被循环到细胞膜表面，重新发挥生物学作用。IL
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2的胞内转运模式取决于它与三受体亚基的亲和力，一部分可随CD25循环到细胞表面继续发挥生物学作用，而大部分随IL
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2Rβγ进入溶酶体进行降解。此机理为提高IL
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2的效果带来了重要的研究方向。例如，一系列的高亲和CD25突变体已经被研发，用于提高IL
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2在细胞膜表面的存在时间(Rao et al.,protein engineering 16(12),1081
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1087,2003)。我们前期的研究也发现，IL
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2上不同位点定点修饰聚乙二醇可以不同程度影响修饰产物的再循环途径，从而显著影响IL
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2的细胞膜存在时长。尽管如此，由于IL
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2与CD25的结合依然是非共价的可逆结合，而且突变体依然存在半衰期短问题，因此单纯用突变的方式增强IL
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2与CD25亲和力，并不能有效获得偏向激活Treg的IL
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2激动剂。
[0004]如果能使IL
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2与CD25产生不可逆的共价结合，则有望大幅度提高IL
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2随CD25的再循环利用率，从而提高IL
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2在CD25高表达细胞，例如Treg细胞的持续性作用，从而增强IL
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2激活Treg细胞的偏向性和有效性，可用于多种自身免疫病的治疗。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术提供可以与CD25产生共价交联的IL
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2突变体，及其在治疗自身免疫病中的应用。
[0006]首先，本专利技术提供可使人白介素
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2于CD25产生共价结合的位点，所选修饰位点选自：示于SEQ ID NO：1的第R38位、L72位或他们的组合。本专利技术选择在IL
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2的特定位点插入具有临近反应活性的非天然氨基酸Fluorosulfate
‑
L
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tyrosine(FSY)，其在自然状态下保持惰性，而在与组氨酸上咪唑环侧链相离足够接近的时候，可与其发生共价结合反应，进而产生稳定不可逆的共价交联。所选位点从IL
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2与CD25结合的空间结构上，距离CD25的第H120位足够接近，可以促进共价交联反应的发生。
[0007]本专利技术还提供定点突变的人白介素
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2，其在所述的特定位点的一个氨基酸或多个氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸为所示的非天然氨基酸FSY，所述特定位点选自：示于SEQ ID NO：1的第R38，第L72位，或两个位点的组合。
[0008]定点突变的人白介素
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2，其与示于SEQ ID NO：1的序列的区别在于：在SEQ ID NO：1所示的序列的第N位的氨基酸被突变为FSY，所述突变氨基酸与SEQ ID NO：1所示的序列的连接方式如下式(II)所示：
[0009][0010]由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第R38位、L72位位氨基酸中的一个或两个，
[0011]R1为SEQ ID NO：1所示序列的第1至第N
‑
1位氨基酸残基，
[0012]R2为SEQ ID NO：1所示序列的第N+1位至C末端的氨基酸残基，
[0013]本专利技术还提供经PEG修饰的所述的特定位点突变的人白细胞介素
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2，其在修饰位置引入的修饰剂分子量范围为5kDa，10kDa，20kDa或40kDa。
[0014]具体地，经PEG修饰的特定位点突变的人白细胞介素
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2是R38位点突变为FSY的突变体R38
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FSY；L72突变为FSY的突变体L72
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FSY；R38和L72双突变的突变体R38/L72
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FSY；5kDa
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PEG修饰的R38
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FSY，5K
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PEG
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R38FSY；10kDa
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PEG修饰的R38
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FSY，10K
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PEG
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R38FSY；20kDa
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.与CD25受体产生共价交联的人白介素
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2，其特征在于，示于SEQ ID No.1的第L72位，R38位中的一个氨基酸或两个氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸为所示的非天然氨基酸Fluorosulfate
‑
L
‑
tyrosine。2.如权利要求1所述的可与CD25产生共价交联的人白细胞介素
‑
2，其特征在于，所述的可与CD25产生共价交联的人白细胞介素
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2经过修饰，修饰剂为不同分子量的PEG修饰剂。3.如权利要求2所述的可与CD25产生共价交联的人白细胞介素
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2，所述PEG修饰剂为乙醛
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甲氧基PEG，丙醛
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甲氧基PEG，琥珀酰亚胺酯
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甲氧基PEG，马来酰亚胺
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甲氧基PEG；所述PEG的分子量是5kDa，10kD...

【专利技术属性】
技术研发人员：张博，张烜，周德敏，孙家琦，
申请(专利权)人：北京医院北京大学，
类型：发明
国别省市：