一种利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法。首先合成具备识别磷酸根功能的聚合物，然后利用偶联反应将功能聚合物接枝到人工纳米通道内表面。通道内聚合物与磷酸化产物磷酸化肽具有特异性相互作用，并会造成聚合物层发生不同程度的收缩，导致在施加电压下流经通道的离子电流发生相应的变化，进而实现对磷酸化的检测。并随着磷酸化反应的进行(即磷酸化产物——磷酸化肽的量逐渐增多)，该功能纳米通道的电流也发生随时间的相应变化，因此实现实时的磷酸化监测。该功能纳米通道方法操作简单、成本低、无需标记，能够实时监测激酶磷酸化发生，为小分子激酶抑制剂的筛选提供了一种新手段。了一种新手段。

【技术实现步骤摘要】
一种利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法


[0001]本专利技术涉及一种利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，具体涉及聚合物修饰功能纳米通道的构筑、磷酸化肽识别和磷酸化反应监测领域。

技术介绍

[0002]蛋白质磷酸化是迄今为止最丰富和最普遍的蛋白质翻译后修饰，控制着几乎所有细胞过程。真核生物中的蛋白磷酸化通常发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上，并且由催化磷酸化的磷酸激酶和去磷酸化的磷酸酯酶精确控制。许多疾病与磷酸化(或去磷酸化)失调直接相关，包括各种癌症、神经系统疾病和糖尿病等严重危及人类健康的疾病。例如，慢性粒细胞白血病是由酪氨酸激酶的异常活化而导致蛋白质发生过度酪氨酸磷酸化所引起的疾病。目前，治疗磷酸化异常所造成疾病的一种有效手段是服用小分子激酶抑制剂，其能有效的降低相应激酶的活性，截至目前已经有50多种小分子激酶抑制剂被批准上市。
[0003]小分子激酶抑制剂研发的主要工作在于检测在抑制剂存在下激酶能否催化底物发生磷酸化。目前最常用的检测手段是采用[γ-32
P]标记的三磷酸腺苷作为底物，激酶催化磷酸化后，相应的[γ-32
P]被转移到磷酸化产物上，检测产物的放射性即实现磷酸化的检测进而证明磷酸化确已发生。然而这一方法通常会造成放射性废物的产生。另外，一些特异性抗体被用于磷酸化检测和激酶抑制剂研发，但是高成本的抗体限制了其广泛使用。近十几年来，一些光学探针法(包括荧光和冷光)也被开发用来检测磷酸化，然而需要对底物进行标记的操作依然限制了这一类方法的发展。因此，一种绿色免标记的检测方法对于磷酸化的检测和激酶抑制剂的筛选则显得十分重要。
[0004]近年来，仿生离子纳米通道的研究日趋繁荣，这种人工纳米通道能够模拟生物离子通道开-关进而引起通过的离子电流变化，这种特性提供了一种分子识别传感的策略。因此，本专利技术中，我们将纳米通道用于磷酸化肽的检测，开发了一种实时监测磷酸化反应的方法，在激酶抑制剂的筛选中具有潜在应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在开发一种功能纳米通道实现检测磷酸化肽和实时监测激酶磷酸化反应。首先合成具备识别磷酸根功能的聚合物，然后利用偶联反应将功能聚合物接枝到人工纳米通道内表面。通过在纳米通道内部接枝对磷酸根具有特异性识别作用的功能聚合物，磷酸化肽分子能够诱导接枝的聚合物发生不同程度的收缩，进而引起流经纳米通道的离子电流发生变化，因此实现对磷酸化肽的检测。激酶催化底物肽发生磷酸化，随着反应的进行(即磷酸化产物——磷酸化肽的量逐渐增多)，产物磷酸化肽逐渐增多，离子电流变化的幅度逐渐增大，遂实现磷酸化实时检测。该功能纳米通道方法操作简单、成本低、无需标记，能够实时监测激酶磷酸化发生，为小分子激酶抑制剂的筛选提供了一种新手段。
[0006]本专利技术采用技术方案具体如下：
[0007]一种利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，将功能纳米通道固定于电化学池
的模具中，其中纳米通道膜作为隔膜允许电解质离子穿过，在电压驱动下电化学池中的离子会穿过纳米通道产生电流；将以多肽为底物混合相应蛋白激酶配制而成的磷酸化反应溶液加入功能纳米通道两侧电化学池中开始磷酸化反应，该功能纳米通道能够识别磷酸化产生的磷酸化肽，进而诱导通道电流发生变化；随着反应的进行，通道电流随之而发生变化，因此通过实时测试电流的变化则实现了对磷酸化的实时监测。
[0008]其中电化学池中间两个聚四氟乙烯模块，夹具是不锈钢的，用螺丝紧紧夹紧中间的聚四氟模块。
[0009]所述功能纳米通道包括纳米通道和接枝到纳米通道内表面的功能聚合物。
[0010]所述纳米通道为聚对苯二甲酸乙二酯多孔膜或单孔膜一种，或聚酰亚胺多孔膜或单孔膜中的一种。
[0011]所述功能聚合物的分子结构如下：
[0012][0013]其中，接枝量为1～99％(以伯氨基数量为基数)，n为20～120。
[0014]所述磷酸化为蛋白激酶催化的在多肽基底上发生的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸磷酸化。
[0015]所述蛋白激酶为丝氨酸/苏氨酸激酶或酪氨酸激酶。
[0016]磷酸化反应溶液的缓冲液为pH为7.5的Tris盐酸盐缓冲液，并包含50μM的三磷酸腺苷，2mM的二硫苏糖醇，10mM氯化镁，10mM的氯化钠。
[0017]利用电极在电化学池两端施加-2～+2V的线性扫描电压，间隔电压为0.2V，间隔时间为1S，获得电流-电压(I-V)曲线。
[0018]功能纳米通道的制备方法具体为：首先在主链聚合物链上修饰功能识别单元苯基胍，然后将带有苯基胍的聚合物接枝到纳米通道内表面，具体步骤：称取0.5～1.5g对胍基苯甲酸盐酸盐溶于30mL水/二甲基亚砜(v/v＝2/1),再加入0.5～2g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.4～1.5g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌0.5～4小时。取0.5～2g聚乙烯亚胺溶于20mL水，逐滴加入到上述反应溶液中，室温下反应12～24小时；然后将反应溶液装入透析袋(截留分子量3500)，于水中透析1～5天，冻干制得所需聚合物。将纳米通道膜置入烧杯中，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于MES(2-N-吗啉乙磺酸一水合物)缓冲液(pH5.5，0.1mol/L)，活化有机多孔膜1h；然后用水彻底清洗有机纳米通道膜，再将有机纳米通道膜浸入到5ml溶有25～200mg聚合物的水溶液中，室温条件下反应12～24h，取出用大量水清洗，浸泡于水中，备用。
[0019]功能纳米通道检测磷酸化肽的具体步骤如下：
[0020]步骤1、将聚合物修饰后的功能纳米通道膜放入电化学池夹具之间，然后向池中注
入电解液，静置5～10分钟，在电化学池两端插上电极用皮安计测量其跨膜电流；
[0021]步骤2、移除步骤1添加的电解液，重新加入溶解有标准磷酸化肽的电解质溶液，在电化学池两端插上电极用皮安计实时测量其跨膜电流。
[0022]所述步骤1和2中电解液为0.01M NaCl溶液。
[0023]所述步骤1中电极为银-氯化银电极、汞-氯化汞、石墨或铂丝电极；步骤2中电极为银-氯化银电极、汞-氯化汞或者石墨电极。
[0024]所述步骤1和步骤2中采用皮安计测量跨膜离子电流变化时，电源在电极两端施加-2～+2V的扫描电压，间隔电压为0.2V，间隔时间为1S，获得电流-电压曲线。
[0025]功能纳米通道实时监测磷酸化的具体步骤：
[0026]步骤1、将聚合物修饰后的功能纳米通道膜放入电化学池夹具之间，然后向池中注入电解液，热水浴加热电化学池并维持在37度左右，静置5～10分钟，在电化学池两端插上电极用皮安计测量其跨膜电流；
[0027]步骤2、移除步骤1添加的电解液，重新加入溶有底物肽和对应激酶的反应溶液，温度维持37度，在电化学池两端插上电极用皮安计实时测量其跨膜电流。
[0028]所述步骤1中电解液为pH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，其特征在于：该方法将功能纳米通道固定于电化学池的模具中，将以多肽为底物混合相应蛋白激酶配制而成的磷酸化反应溶液加入功能纳米通道两侧电化学池中开始磷酸化反应，通过实时测试电流的变化实现对磷酸化的实时监测。2.根据权利要求1所述的利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，其特征在于：所述功能纳米通道包括纳米通道和接枝到纳米通道内表面的功能聚合物。3.根据权利要求2所述的利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，其特征在于：所述纳米通道为聚对苯二甲酸乙二酯多孔膜或单孔膜一种，或聚酰亚胺多孔膜或单孔膜中的一种。4.根据权利要求2所述的利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，其特征在于：所述功能聚合物的分子结构如下：其中，接枝量为1～99％(以伯氨基数量为基数)，n为20～120。5.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：卿光焱，李闵闵，熊雨婷，王东东，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：