一种高效诱导里氏木霉产酶的水稻纤维素纳米纤维及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高效诱导里氏木霉产酶的水稻纤维素纳米纤维及其应用，属于里氏木霉诱导产酶技术领域，该水稻纤维素纳米纤维由水稻基因编辑突变体cesa9茎秆处理制得，该ceas9突变体的OsCESA9蛋白第977

【技术实现步骤摘要】
一种高效诱导里氏木霉产酶的水稻纤维素纳米纤维及其应用


[0001]本专利技术涉及里氏木霉诱导产酶领域，特别是涉及一种高效诱导里氏木霉产酶的水稻纤维素纳米纤维及其应用。

技术介绍

[0002]纤维素酶是降解纤维素并最终生成葡萄糖的一类蛋白酶，在生物质能源开发中起着重要作用。目前商用纤维素酶主要通过诱导里氏木霉分泌获得，其中诱导物的种类和特征很大程度影响着纤维素酶的产量和活性。诱导里氏木霉产酶的碳源包括可溶性碳源和不可溶性碳源两种，其中可溶性碳源主要包括纤维二糖、山梨醇、乳糖和槐糖等，这些试剂通常较昂贵，难以在大规模生产中投入使用。不溶性碳源主要包括纤维素和含纤维素的生物质材料，具有来源广泛、价格低廉的优势。然而，由于植物纤维素的结晶度和聚合度较高，难以分解成可被里氏木霉利用的寡糖或单糖，因此诱导产酶效果不佳。因此，开发高效诱导里氏木霉产酶的纤维素材料对纤维素酶的高效生产和生物质能源的高效开发有重要意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种高效诱导里氏木霉产酶的水稻纤维素纳米纤维及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术通过基因编辑水稻次生细胞壁纤维素合酶基因OsCESA9，降低水稻秸秆纤维素的结晶度、聚合度等特征，使其纤维素纳米纤维更容易被里氏木霉利用，从而达到更好的诱导产酶效果。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0005]本专利技术提供一种水稻次生细胞壁纤维素合酶突变蛋白，所述水稻次生细胞壁纤维素合酶突变蛋白是氨基酸序列为SEQ ID No.1的水稻次生细胞壁纤维素合酶第977
‑
979位氨基酸NNG突变为S，第1043
‑
1055位氨基酸ARGPDVRQCGINC突变为VQGP。
[0006]进一步地，所述水稻次生细胞壁纤维素合酶突变蛋白中的氨基酸序列为SEQ ID No.3。
[0007]本专利技术还提供一种基因，编码上述的水稻次生细胞壁纤维素合酶突变蛋白。
[0008]进一步地，所述基因是核苷酸序列为SEQ ID No.2的OsCESA9基因CDS序列第2930位碱基处缺失6bp碱基，第3128位碱基处插入1bp碱基，其中，缺失的6bp碱基为ACAACG，插入的1bp碱基为T；所述OsCESA9基因的基因编辑靶位点位于OsCESA9基因3
’
端，两个靶位点序列分别为：
[0009]target 1：CCATCAACAACGGCTCCGAGGCG；
[0010]target 2：TCCCTTCACCATCAAGGCCAGGG。
[0011]进一步地，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4。
[0012]本专利技术还提供一种基因编辑重组质粒，含有上述基因编辑靶位点序列。
[0013]本专利技术还提供一种重组工程菌株，含有上述的基因编辑重组质粒。
[0014]本专利技术还提供一种上述的水稻次生细胞壁纤维素合酶突变蛋白、上述的重组工程
菌株的应用，用于水稻生产水稻纤维素纳米纤维或水稻纤维素纳米晶。
[0015]本专利技术还提供一种水稻纤维素纳米纤维或水稻纤维纳米晶，由水稻秸秆处理制得，所述水稻为上述的水稻次生细胞壁纤维素合酶突变蛋白，或所述水稻经过上述的重组工程菌株侵染获得。
[0016]本专利技术还提供一种上述的水稻纤维素纳米纤维或水稻纤维纳米晶在诱导里氏木霉产纤维素酶中的应用。
[0017]本专利技术公开了以下技术效果：
[0018](1)水稻突变体cesa9纤维素特征改善
[0019]cesa9茎秆纤维素结晶度下降6.6％；纤维素微纤丝长度下降34.7％；纤维素纳米晶长度下降22.0％；纤维素纳米晶直径下降18.0％；粗纤维素和晶体纤维素聚合度分别下降16.8％和39.7％。
[0020](2)突变体纤维素纳米纤维诱导里氏木霉产酶蛋白量和酶活提高
[0021]cesa9纤维素纳米纤维诱导产酶滤纸酶活达到0.46FPU/mL，相比野生型升高26.4％；cesa9纤维素纳米纤维诱导里氏木霉分泌的总蛋白量达到0.94mg/mL，相比野生型升高43.9％；cesa9纤维素纳米纤维诱导里氏木霉产酶pNPC活性达到0.05U/mL，相比野生型升高99.9％；cesa9纤维素纳米纤维诱导里氏木霉产酶中β
‑
葡萄糖苷酶酶活达到0.08U/mL，相比野生型升高138.1％。
[0022](3)突变体纤维素纳米纤维诱导里氏木霉产酶酶系丰富，酶解生物质效率高
[0023]突变体纤维素纳米纤维诱导酶系中包含了2种纤维二糖酶、8种葡萄糖苷酶和3种木聚糖酶，酶解桉树、蕨类、油菜、芦苇、小麦、玉米和水稻生物质的效率分别达到11.56％、22.16％、53.79％、54.64％、56.89％、81.34％和88.94％(比纤维素)，相比野生型分别升高33.3％、25.1％、16.9％、19.2％、15.3％、15.5％和11.7％。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1为水稻突变体cesa9的表型及突变方式；其中，A.水稻植株和茎秆脆性照片；B.cesa9基因突变方式和测序图谱；C.cesa9基因突变位点示意图；D.cesa9蛋白突变位点示意图；E.cesa9中OsCESA9蛋白与水稻、拟南芥和杨树次生细胞壁纤维素合酶蛋白序列比对图。
[0026]图2为水稻突变体cesa9茎秆纤维素特征；其中，A.原子力显微镜原位观察经16％NaClO2处理后水稻茎秆切片中纤维素微纤丝照片；上图标尺为400nm，下图为上图白色方框部分的放大图片，标尺为100nm；B.原子力显微镜观察野生型与cesa7纤维素纳米晶照片；上图标尺为800nm，下图为上图白色方框部分的放大图片，标尺为200nm；C.野生型与cesa9茎秆纤维素含量；D.野生型与cesa9茎秆纤维素结晶度；E.野生型与cesa9纤维素微纤丝长度；F.野生型与cesa9纤维素纳米晶长度；G.野生型与cesa9纤维素纳米晶直径；H.野生型与cesa9粗纤维素和晶体纤维素聚合度。
[0027]图3为水稻突变体cesa9纤维素纳米纤维诱导里氏木霉产酶酶活和总蛋白量；其中，A.野生型与cesa9纤维素纳米纤维诱导里氏木霉产酶滤纸酶活；B.野生型与cesa9纤维素纳米纤维诱导里氏木霉分泌的总蛋白量；C.野生型与cesa9纤维素纳米纤维诱导里氏木霉产酶内切葡聚糖酶活性；D.野生型与cesa9纤维素纳米纤维诱导里氏木霉产酶中β
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葡萄糖苷酶酶活；E.野生型与cesa9纤维素纳米纤维诱导产酶酶解七种生物质的酶解产糖效率。
具体实施方式
[0028]现详细说明本专利技术的多种示例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水稻次生细胞壁纤维素合酶突变蛋白，其特征在于，所述水稻次生细胞壁纤维素合酶突变蛋白是氨基酸序列为SEQ ID No.1的水稻次生细胞壁纤维素合酶第977
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979位氨基酸NNG突变为S，第1043
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1055位氨基酸ARGPDVRQCGINC突变为V QGP。2.根据权利要求1所述的水稻次生细胞壁纤维素合酶突变蛋白，其特征在于，所述水稻次生细胞壁纤维素合酶突变蛋白中的氨基酸序列为SEQ ID No.3。3.一种基因，其特征在于，编码权利要求1或2所述的水稻次生细胞壁纤维素合酶突变蛋白。4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因是核苷酸序列为SEQ ID No.2的OsCESA9基因CDS序列第2930位碱基处缺失6bp碱基，第3128位碱基处插入1bp碱基，其中，缺失的6bp碱基为ACAACG，插入的1bp碱基为T；所述Os CESA9基因的基因编辑靶位点位于OsCESA9基因3
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【专利技术属性】
技术研发人员：彭良才，夏涛，彭昊，胡振，刘鹏，王艳婷，张冉，涂媛苑，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：