一种刺参基因编辑体系的构建方法技术

本发明专利技术属水产遗传育种领域，具体地说是一种刺参基因编辑体系的构建方法。获取刺身精、卵，获取后将卵细胞固定排成单细胞列，并对其受精，经配置的含刺参目标基因sgRNA的混合液注入至上述排成单细胞列的受精后的刺参卵中，注射剂量为刺参胚胎体积的8

【技术实现步骤摘要】
一种刺参基因编辑体系的构建方法


[0001]本专利技术属水产遗传育种领域，具体地说是一种刺参基因编辑体系的构建方法。

技术介绍

[0002]基因编辑是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。在育种过程中，基因编辑技术可以实现品种中目标性状遗传位点的修饰与改变，从而加速品种改良。尽管基因编辑技术在动物育种中尚处于初始发展阶段，但在以基因组选择为核心的遗传育种中具有广阔前景，可实现目标物种目标性状的高效、精准改良。锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator
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Like Effector Nucleases，TALENs)和成簇规律间隔短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9)是3种不同的基因编辑工具。CRISPR/Cas系统本质上是RNA引导的核酸酶。与ZFN、TALEN通过蛋白质
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DNA相互作用识别靶序列的核酸酶不同，CRISPR/Cas核酸酶是通过RNA和DNA碱基配对来识别靶序列。CRISPR/Cas9提供了一种更低成本、高效且易于使用的基因编辑系统。与TALENS相比，CRISPR采用易于传递的小蛋白质，更快捷；与ZFN相比，CRISPR不需要成对的蛋白质即可靶向特定基因座，更方便。CRISPR/Cas除了具有一次性促进多重基因组修饰的能力外，与其他2种DNA核酸酶相比设计要容易很多。
[0003]与其他海水经济动物相比,刺参因性成熟年龄需3年以上,故新品种培育周期至少需12～13年以上,具有育种周期长、育种效率低的限制因素。此外,因体长、体重、疣足数量、疣足长度、体色等关键数量性状难以定量与定性的测定,造成了性状的基础数量遗传特性解析不明确。因此,以杂交育种、选择育种为代表的传统育种技术在时效性、可靠性等方面已不能满足当前刺参良种选育的技术要求。因此挖掘具有育种价值的分子标记，开展含有优良目标性状的刺参体色新品(种)系的优化设计选育，建立刺参基因编辑育种技术，实现刺参体色新品系精准育种体系，是刺参产业健康可持续发展的迫切需求。
[0004]随着CRISPR技术的完善与发展，基因编辑在水产动物中的应用也逐渐广泛。水产品是世界第三大动物蛋白来源，水产动物提供了一种经济且优质的动物蛋白。因此，基因编辑技术在水产动物中的应用，使得我们可以获得更多优质渔业资源，从而助力渔业健康可持续发展。目前，CRISPR/Cas9已被成功应用于斑马鱼、罗非鱼、大西洋鲑、鲤鱼、草鱼、舌鳎等鱼类，贝类中的大西洋舟螺、静水椎实螺、乌贼、长牡蛎也实现了成功应用。然而对于棘皮动物而言，目前CRISPR/Cas9只在海胆中成功进行了应用。刺参作为棘皮动物中重要代表性物种，其基因编辑体系尚未建立，刺参显微注射等研究亟待开展。
[0005]以目前基因编辑运用比较成熟的斑马鱼为例，其显微注射前期准备过程大体如下：注射的前一天，按照雌:雄为1:1或2:1的比例将成年斑马鱼放置于配种缸，用隔板分开。注射的早上，抽去隔板，雌雄鱼开始交配。一般在十多分钟左右亲鱼产卵并使卵受精。一般第一次抽板2缸鱼左右，随后根据实验进度适时给其它缸抽板。可在抽板前先将内缸连同亲鱼换到另一干净外缸中以节约清洁胚胎的时间。亲鱼产卵后，取180μm孔径的过滤网，收集
外缸底部的鱼卵，并用养殖水清洗鱼卵2
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3次。应尽量收集20min内的受精卵(即对于同一缸亲鱼，两次收集受精卵的时间间隔不得超过20分钟，以保证发育阶段的一致性)。受精卵分选和洗净后，用吸管将收集的卵置于平板培养皿中，清除平皿内的异物和胚胎周围的水，采用干法注射。
[0006]由于物种的特异性，斑马鱼等生物的精卵获取方式对于刺参而言并不适用，就连亲缘关系最近的海胆，其精卵获取方式是通过注射KCL来获得，对于刺参而言同样不适用。此外，斑马鱼等生物采用干法注射，刺参无法进行干法注射，会大批死亡。因此，建立试用于刺参的专用的基因编辑体系迫在眉睫。

技术实现思路

[0007]为实现构建刺参体色新品系精准育种体系，解决刺参遗传选育中的定点、精准技术难点，本专利技术目的在于提供一种刺参基因编辑体系的构建方法，从而获得具有目标优良性状的刺参新品系，为刺参产业健康发展提供支持。
[0008]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用技术方案为：
[0009]一种刺参基因编辑体系的构建方法，精、卵获取、固定显微注射、目标基因gRNA设计、配置注射体系和显微注射，获取刺身精、卵，获取后将卵细胞固定排成单细胞列，并对其受精，经配置的含刺参目标基因sgRNA的显微注射混合液注入至上述排成单细胞列的受精后的刺参卵中，注射剂量为刺参胚胎体积的8
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12％，在23℃下孵育显微注射后的胚胎，进而可获得刺参基因编辑体系。
[0010]所述获得刺参卵子固定于含硫酸鱼精蛋白溶液的培养皿中排成单细胞列，而后将精液打入培养皿中，使卵子完成受精；固定后受精的刺参卵在显微镜下注射含刺参目标基因sgRNA的显微注射混合液。
[0011]所述固定为在显微注射用的培养皿底部背面划线，并将培养皿内用0.1％
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1％的硫酸鱼精蛋白溶液润洗，而后用口吸器将卵细胞整齐地排列在涂有硫酸鱼精蛋白的注射盘表面划线处。
[0012]所述润洗将0.1％
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1％的硫酸鱼精蛋白溶液涂在培养皿上，沥干，然后立即用去离子水漂洗，或者晾干，用去离子水漂洗，待用。
[0013]所述刺参卵子的获得为利用神经肽NGIWY
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NH2促熟刺参获得其卵细胞。
[0014]将NGIWY
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NH2(10μM)注射入刺参体腔中，注射的量约为刺参的0.1％(v/w)，以刺参开始出现摇晃身体的现象起15
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20分钟后排卵，收集刺身卵子。
[0015]所述含刺参目标基因sgRNA的混合液为每微升混合液中500ng Cas9蛋白、300ng目标基因的sgRNA、0.2μg 20％甘油、0.25μg FITC和0.2μgRNase
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free水。
[0016]所述含刺参目标基因的sgRNA的显微注射混合液中Cas9蛋白与sgRNA浓度比例为30:1—1:1。
[0017]所述刺参与生长发育相关基因编辑的gRNA的获得：根据CRISPRscan(http://www.crisprscan.org/？page＝sequence)设计gRNA序列，并根据CRISPRscan score选择分值高的gRNAs,配置显微注射混合液时，可以每条序列单独使用，也可以全部混合使用或者组合使用。
[0018]更进一步的刺参基因编辑体系的构建步骤为：
[0019]1)5月份开始于山东省烟台莱州海区收集获取刺参种参。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种刺参基因编辑体系的构建方法，精、卵获取、显微注射用卵细胞固定、目标基因sgRNA设计、配置注射体系和显微注射，其特征在于：获取刺身精、卵，获取后将卵细胞固定排成单细胞列，并对其受精，经配置的含刺参目标基因sgRNA的混合液注入至上述排成单细胞列的受精后的刺参卵中，注射剂量为刺参胚胎体积的8
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12％，在23℃下孵育显微注射后的胚胎，进而可获得刺参基因编辑体系。2.按权利要求1所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于所述获得刺参卵子固定于含硫酸鱼精蛋白溶液的培养皿中排成单细胞列，而后将精液打入培养皿中，使卵子完成受精；固定后受精的刺参卵在显微镜下注射含刺参目标基因sgRNA的显微注射混合液。3.按权利要求2所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于：所述固定为在显微注射用的培养皿底部背面划线，并将培养皿内用0.1％
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1％的硫酸鱼精蛋白溶液润洗，而后用口吸器将卵细胞整齐地排列在涂有硫酸鱼精蛋白的注射盘表面划线处。4.按权利要求2所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于：所述润洗将0.1％
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1％的硫酸鱼精蛋白溶液涂在培养皿上，沥干，然后立即用去离子水漂洗，或者晾干，用去离子水漂洗，待用。5.按权利要求1或2所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于：所述刺参卵子的获得为利用神...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢丽丽，刘石林，江春嬉，杨红生，孙丽娜，张立斌，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：