一种用于捕获PolyA（+）RNA的磁珠、其制备方法及应用技术

本发明专利技术提供用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠的制备方法，包括以下步骤：将羧基磁珠、活化剂和5

【技术实现步骤摘要】
一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠、其制备方法及应用


[0001]本专利技术属于分子诊断领域，尤其涉及一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠、其制备方法及应用。

技术介绍

[0002]信使RNA(Messenger RNA,缩写mRNA)，是由DNA的一条链为模板转录而来的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。真核生物的mRNA是单顺反子，其最显著的特征是具有5'端帽子结构和3'端的poly A的结构，即Poly A(+)RNA。所以可以利用碱基配对原理，将Oligo dT探针偶联到固相载体上，当含mRNA的样品(总RNA或细胞裂解物)与之孵育时，mRNA的poly A尾即被特异性的结合到固相载体上，从而将其与其它Poly A(
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)RNA、蛋白等杂质分开，从而达到mRNA特异性分离与富集。尤其随着mRNA疫苗的兴起，以及NGS转录组测序需求大幅提升，市场上对poly A(+)mRNA捕获纯化需求越来越多。
[0003]目前Poly A(+)RNA的纯化有多种方法，如超速离心法、免疫法，柱层析法。目前市面上纯化Poly A(+)RNA的方法应用最广泛的为层析柱法，包括阴离子交换层析柱法，但此方法相较回收率较低、应用较少。另一种为亲和层析柱法，此方法应用较广泛，回收率较高，但相较磁珠法，操作时间长、无法实现完全的自动化、高通量，且需要昂贵的设备，无法实现一次实验进行两次结合以达到更高的纯度。磁珠法应用于生物活性物质的捕获与富集等领域越来越普遍，可实现Poly A(+)RNA的全自动、高通量、高纯度捕获。
[0004]磁珠(也称，磁性微球)一般是指是直径大小为微米或纳米级别的超顺磁颗粒。磁珠可以通过外加磁场进行控制，实现处理过程的自动化；磁珠粒径小，具有较大的比表面积；磁珠具有丰富的表面材质和功能基团，易于进行生物修饰、偶联等，从而广泛应用于生物活性物质(例如，核酸、蛋白、细胞)的富集、分离与捕获、免疫检测、药物筛选、疾病的诊断和治疗等领域。
[0005]但市面上大多数采用链霉亲和素磁珠搭配生物素标记的Oligo dT(寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核酸)探针，来实现Poly A(+)RNA的亲和捕获，但此方法成本高、稳定性较差，不适用于含蛋白变性剂的样本以及重复再生使用等。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠、其制备方法及应用，本专利技术中的磁珠稳定性好，不会引入外源污染源，耐受高温以及含变性剂等样本中Poly A(+)RNA的捕获。可实现操作过程的高通量、自动化、捕获效率高、操作简单、无需昂贵设备等优点。
[0007]本专利技术提供一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0008]将羧基磁珠、活化剂和5
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端伯氨基修饰的Oligo dT探针在偶联缓冲试剂中混合，在室温下反应16～20小时，得到用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠。
[0009]优选的，所述磁珠的外层为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸缩水甘油
酯、琼脂糖或葡聚糖；
[0010]所述磁珠的粒径为100nm～150μm。
[0011]优选的，所述磁珠的浓度为5～100mg/mL。
[0012]优选的，所述活化剂为碳二亚胺、N
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羟基硫代琥珀酰亚胺、N
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羟基琥珀酰亚胺的一种或几种；
[0013]所述活化剂的浓度为10～100mg/mL。
[0014]优选的，所述5
’
端伯氨基修饰的Oligo dT探针长度为10～30nt；
[0015]所述羧基磁珠质量与5
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端伯氨基修饰的Oligo dT探针的物质的量之比为1mg：(0.1～5)nmol。
[0016]优选的，所述偶联缓冲试剂包括吗啉乙磺酸、磷酸盐缓冲液、咪唑或碳酸氢钠；
[0017]所述偶联缓冲试剂的pH为4.0～9.0；所述偶联缓冲试剂的浓度为50～100mmol/L。
[0018]优选的，将反应得到的磁珠与封闭液混合，进行封闭反应，然后使用洗涤缓冲液进行洗涤，最后将磁珠置于保存液中进行保存。
[0019]优选的，所述封闭液为乙醇胺、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、牛血清白蛋白和甘氨酸中的一种或几种；
[0020]所述封闭液的pH为8.0～8.5，浓度为2～4mol/L。
[0021]本专利技术提供如上文所述的制备方法制备得到的捕获Poly A(+)RNA的磁珠。
[0022]本专利技术提供如上文所述的捕获Poly A(+)RNA的磁珠在捕获Poly A(+)RNA中的应用。
[0023]本专利技术提供用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠的制备方法，包括以下步骤：将羧基磁珠、活化剂和5
’
端伯氨基修饰的Oligo dT探针在偶联缓冲试剂中混合，在室温下反应16～20小时，得到捕获Poly A(+)RNA的磁珠。本专利技术采用聚合物表面材质的磁珠，采用一步法完成活化和偶联，将特定修饰的Oligo dT探针共价偶联到磁珠上，用于Poly A(+)RNA的捕获。此工艺较链霉亲和素
‑
生物素法可大幅降低成本、且磁珠稳定性好，不会引入外源污染源，耐受高温以及含变性剂等样本中Poly A(+)RNA的捕获。可实现操作过程的高通量、自动化、捕获效率高、操作简单、无需昂贵设备等优点。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0025]图1为本专利技术应用例1中从甘蓝总RNA中捕获Poly A(+)RNA的RT
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qPCR检测；图1中，曲线1表示捕获前GAPDHmRNA，曲线2表示捕获后GAPDH mRNA，曲线3表示捕获前18S rRNA，曲线4表示捕获后18S rRNA；
[0026]图2为本专利技术应用例2中从甘蓝叶片裂解粗提物中捕获Poly A(+)RNA的RT
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qPCR检测；图2中，曲线1表示对照磁珠捕获GAPDHmRNA，曲线2表示本专利技术磁珠捕获GAPDH mRNA，曲线3表示对照磁珠非特异捕获18S rRNA，曲线4表示本专利技术磁珠非特异捕获18S rRNA。
具体实施方式
[0027]本专利技术提供了一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0028]将羧基磁珠、活化剂和5
’
端伯氨基修饰的Oligo dT探针在偶联缓冲试剂中混合，在室温下反应16～20小时，得到捕获Poly A(+)RNA的磁珠。
[0029]本专利技术中的制备方法主要包括以下步骤：
[0030](1)磁珠清洗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠的制备方法，包括以下步骤：将羧基磁珠、活化剂和5
’
端伯氨基修饰的Oligo dT探针在偶联缓冲试剂中混合，在室温下反应16～20小时，得到用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磁珠的外层为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、琼脂糖或葡聚糖；所述磁珠的粒径为100nm～150μm。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述磁珠的浓度为5～100mg/mL。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述活化剂为碳二亚胺、N
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羟基硫代琥珀酰亚胺、N
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羟基琥珀酰亚胺的一种或几种；所述活化剂的浓度为10～100mg/mL。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述5
’
端伯氨基修饰的Oligo dT探针长度为10～30nt；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张慧，黄明贤，任辉，颜光涛，
申请(专利权)人：苏州海狸生物医学工程有限公司，
类型：发明
国别省市：