一种具有更广DNA靶向范围的工程化CAS9制造技术

本发明专利技术提供了对原型间隔区相邻基序(PAM)序列具有改变的特异性的变体金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)蛋白。本发明专利技术还涉及使用变体SaCas9蛋白改变基因组DNA序列的CRISPR/Cas9系统和方法。还公开了产生具有改变的PAM特异性的变体Cas9蛋白的方法。性的变体Cas9蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种具有更广DNA靶向范围的工程化CAS9
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2019年4月25日提交的美国临时专利申请号62/838,498的权益，该专利以其全文形式被援引加入本文。


[0002]本专利技术涉及具有更广DNA靶向范围的工程化CAS9蛋白以及使用它们的方法、试剂盒、组合物和系统。

技术介绍

[0003]最初在细菌和古细菌中发现的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统可以适应性地抵抗外来遗传物质，利用RNA引导的蛋白质机制和复杂的分子机制提供微生物免疫(Mojica et al.,J.Mol.Evol.,60:174
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182(2005)；Bolotin et al.,Microbiology,151:2551
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2561(2005)；Barrangou et al.,Science,315:1709
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1712(2007)；Garneau et al.,Nature,468:67(2010)；Deltcheva et al.,Nature,471:602(2011)；Sapranauskas et al,Nucl.Acids Res.,39:9275
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9282(2011)；Jinek et al.,Science,337:816
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821(2012)；Gasiunas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,109:E2579
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E2586(2012)；和Wiedenheft et al.,Nature,482:331(2012))。最近的进展使得利用定制的CRISPR系统在真核生物中进行基因组编辑成为可能(Cong et al.,Science,339:819
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823(2013)；Mali et al.,Science,339:823
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826(2013)；Jiang et al.,Nature Biotech.,31:233
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239(2013)；Jinek et al.,Eli/e,2:e00471(2013)；Cho et al.,Nature Biotech.,31:230(2013)；和Hwang et al.,Nature Biotech.,31:227(2013))。示例性II型CRISPR系统采用与单引导RNA(sgRNA)复合的Cas9蛋白，形成可切割双链DNA(dsDNA)靶标的可编程核酸内切酶。dsDNA底物包含与sgRNA中的引导序列互补的靶标链((Jinek et al,Science,337:816
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821(2012))和带有靶向识别所需的原型间隔区相邻基序(PAM)的非靶标链(Mojica et al.,J.Mol.Evol.,60:174
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182(2005)；Bolotin et al,Microbiology,151:2551
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2561(2005))。
[0004]广泛使用的来自化脓性链球菌的Cas9(SpCas9)识别PAM序列NGG(Jinek et al.，同上)，而新鉴定的来自金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9)识别更长的PAM序列NNGRRT(Ran et al.,Nature,520:186
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191(2015))。SaCas9比SpCas9小得多，使其在基因治疗应用中的递送更加方便和高效(Ran et al.，同上)。尽管由于其紧凑的尺寸而有望用于临床转化，但SaCas9较长的PAM限制了其靶向范围和应用潜力，例如，当其PAM不在疾病相关位点附近时。最近，发现一组三重突变E782K/N968K/R1015H(KKH)可以有效地将SaCas9 PAM特异性从NNGRRT改变为NNNRRT(Kleinstiver et al.,Nature Biotech.,33:1293
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1298(2015))。此外，野生型SaCas9与sgRNA/DNA结合的结构已经得到解析(Nishimasu et al,Cell,162:1113
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1126(2015))，这为SaCas9功能的分子基础提供了有价值的见解。
[0005]然而，仍然需要具有更广泛PAM特异性的Cas9蛋白，以及用于改变Cas9蛋白的PAM特异性的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了变体金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)蛋白，包含例如SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中一个或更多个氨基酸残基E782、N968、N986和R991被不同的氨基酸取代。还提供了编码变体SaCas9蛋白的核酸序列和载体，以及用于改变宿主细胞中的靶基因组DNA序列的系统和方法。
[0007]本专利技术还提供了产生具有所需PAM特异性的变体Cas9蛋白的方法，该方法包括：(a)分子模拟一个或更多个突变体Cas9蛋白与所需PAM的结合；(b)在(a)的模拟中合成产生与所需PAM结合的一个或更多个突变体Cas9蛋白；(c)结合与宿主细胞中的靶DNA序列互补的引导RNA序列在宿主细胞中表达一个或更多个突变体Cas9蛋白，其中宿主细胞基因组包括靶DNA序列和所需PAM；(d)测量一个或更多个突变体Cas9蛋白的切割活性；和(e)选择与所需PAM结合并切割靶DNA序列的一个或更多个突变体Cas9蛋白，由此产生具有所需PAM特异性的变体Cas9。
[0008]进一步提供包含一种或更多种试剂或其他组分的试剂盒，这些试剂或组分对于实施本文所述的任何方法都是有用的、必要的或足够的。例如，试剂盒可以包括CRISPR试剂(Cas9蛋白、引导序列、质粒等)、转染或施用试剂、阴性和阳性对照样品(例如细胞、模板DNA)、细胞、容纳一个或更多个组分的容器(例如微离心管、盒)、可检测标记、检测和分析工具、软件、说明书等。
附图说明
[0009]图1A是说明用于结合DNA和RNA的SaCas9的MD模拟的模型系统的示意图。DNA的PAM区与其周围的蛋白质残基之间的相互作用被放大。图1B是显示E782
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K910和E782
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G0对的时间相关距离的图。图1C是显示N968
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G3和R1015
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G3对的时间相关距离的图。图1D是显示E782在0、57和80ns的坐标的一系列图像。在E782K突变的FEP计算中，图1D中的Na+离子与E782一起被湮灭，以避免其与出现的K782产生不利的碰撞(或静电排斥)。因此，在自由态的FEP计算中，电解质中的额外Na+(不接近蛋白质复合物)与E782同时被湮灭。
[0010]图2A
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2C是结晶的SaCas9复合物的原子结构示意图。图2A显示了包括四个复合物拷贝(标记为A、B、C和D)的晶胞。图2B显示了拷贝A和B或C和D之间的晶体接触的放大图。图2C显示了拷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种变体金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)蛋白，包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中E782、N968、N986和R991中的一个或更多个残基被不同的氨基酸取代。2.根据权利要求1所述的变体SaCas9蛋白，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基N986被不同的氨基酸取代。3.根据权利要求1或权利要求2所述的变体SaCas9蛋白，其中氨基酸取代选自N986A、N986R、N986K和N986H。4.根据权利要求1所述的变体SaCas9蛋白，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基R991被不同的氨基酸取代。5.根据权利要求1或权利要求4所述的变体SaCas9蛋白，其中氨基酸取代选自R991A、R991K、R991L、R991C和R991V。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的变体SaCas9蛋白，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基N986和R991均被不同的氨基酸取代。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的变体SaCas9蛋白，所述变体SaCas9蛋白进一步包括选自E782、N885、K886、L887、N888、A889、N968、R1015和T1019的SEQ ID NO:1的一个或更多个残基的氨基酸取代。8.根据权利要求7所述的变体SaCas9蛋白，进一步包括以下氨基酸取代中的一个或更多个：E782K、N885K、K886N、K886R、L887K、N888K、A889H、A889K、A889N、N968K、R1015H、T1019R、T1019K和T1019H。9.根据权利要求8所述的变体SaCas9蛋白，所述变体SaCas9蛋白包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列和选自以下的两个或更多个氨基酸取代：(a)N986R和R991A；(b)N986R和R991K；(c)N986R和R991L；(d)N986R、R991A和T1019R；(e)N986R、R991A和T1019K；(f)N986R、R991A和T1019H；(g)N986R、R991K和T1019R；(h)N986R、R991K和T1019K；(i)N986R、R991K和T1019H；(j)N986R、R991L和T1019R；(k)N986R、R991L和T1019K；(l)N986R、R991L和T1019H；(m)N986R、R991C和T1019R；(n)N986R、R991C和T1019K；(o)N986R、R991C和T1019H；(p)N986R、R991V和T1019R；(q)N986R、R991V和T1019K；(r)N986R、R991V和T1019H；(s)N885K和N986R；
(t)K886N和N986R；(u)K886R和N986R；(v)L887K和N986R；(w)N888K和N986R；(x)A889H和N986R；(y)A889K和N986R；(z)A889N和N986R；(aa)N885K、N986R和R991L；(bb)K886N、N986R和R991L；(cc)K886R、N986R和R991L；(dd)L887K、N986R和R991L；(ee)N888K、N986R和R991L；(ff)A889H、N986R和R991L；(gg)A889K、N986R和R991L；(hh)A889N、N986R和R991L；(ii)E782K和N986R；(jj)N968K和N986R；(kk)E782K、N968K和N986R；(ll)E782K、N986R和R1015H；(mm)N968K、N986R和R1015H；(nn)E782K、N968K、N986R和R1015H；(o...

【专利技术属性】
技术研发人员：丛乐，
申请(专利权)人：小利兰斯坦福大学董事会，
类型：发明
国别省市：