一种猫干扰素活性的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种猫干扰素活性的检测方法，该方法通过在检测体系中加入黄芩、拉米夫定两种药物，并在高糖型DMEM培养基环境下，可提高检测体系对猫干扰素的敏感性，解决了现有细胞系猫干扰素检出限过高的问题。细胞系猫干扰素检出限过高的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种猫干扰素活性的检测方法


[0001]本专利技术属于兽用生物制品领域，具体是涉及一种猫干扰素活性的检测方法。

技术介绍

[0002]干扰素(interferon，IFN)是由病毒及其它诱导因素刺激机体产生的一种具有抗病毒、影响细胞生长、免疫调控等多种生物学活性的细胞因子。干扰素分为Ⅰ型和Ⅱ型两类，Ⅰ型干扰素包括IFNα，IFNβ，IFNε，IFNω，IFNτ等。Ⅱ型干扰素为IFNγ。
[0003]近年来，越来越多的人将猫作为宠物饲养，而猫的病毒病危害着猫的健康和生存，因此也受到了越来越多人的重视。目前抗病毒的药物，疫苗是预防和治疗猫病毒病的主要途径。猫干扰素omega(FeIFN
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ω)属于I型干扰素，具有抗病毒，抗增殖和免疫调节功能。Ⅰ型干扰素通过共同的受体干扰病毒复制，阻碍 DNA的复制和蛋白质的合成，增强巨噬细胞表面主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibility Complex，MHC)Ⅱ类分子的表达和细胞活性，因此猫干扰素的活性强弱，直接影响了猫干扰素类抗病毒药物的治疗效果，在干扰素活性的检测时，常用的检测方法为微量细胞病毒抑制法，在Vero细胞，CRFK细胞，Hela 细胞等细胞中，添加干扰素和病毒，反应后通过检测Reed
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Muench法计算半数保护量来确定干扰素的活性。但目前采用的检测体系检测干扰素的活性往往不能达到检出限，其原因是干扰素本身的活性不高，亦或干扰素活性的检测受制于检测体系，导致检测过程中干扰素的不敏感，还尚待查明。/>
技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供了一种猫干扰素活性的检测方法。
[0005]本专利技术的目的还在于克服传统方法检测出的干扰素的活性不高的技术缺陷。
[0006]本专利技术采用微量细胞病变抑制法检测猫干扰素的活性，在检测体系中添加了拉夫米定、黄芩，能够显著提升干扰素的活性。
[0007]为实现以上技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种猫干扰素活性的检测方法，该检测方法添加了拉米夫定和黄芩。
[0009]进一步的，该检测方法选用了高糖型DMEM培养基进行培养。
[0010]进一步的，该检测方法包括：
[0011]1)将含10％FBS的高糖型DMEM培养基铺96孔细胞板；
[0012]2)培养4～6h后加入干扰素，同时加入拉米夫定和黄芩，37℃培养24h；
[0013]3)弃去培养上清，每孔接入VSV病毒，37℃培养24h；
[0014]4)显微镜下观察细胞病变程度，按Reed
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Muench法计算半数保护量，即得到干扰素的活性(单位U)；
[0015]进一步的，拉米夫定含量为10～100μg/mL。
[0016]进一步的，黄芩含量为30～300μg/mL。
[0017]相对于现有技术，本专利技术具有以下优势：
[0018]本专利技术克服了传统方法检测出的干扰素的活性不高的技术缺陷。
[0019]本专利技术为进一步研究猫重组干扰素的生物学活性，为发掘其药物价值以及猫重组干扰素生物制剂的生产奠定了基础。
[0020]干扰素主要是通过诱导细胞合成各种AVP，产生抗病毒蛋白，阻碍病毒的复制和蛋白质的合成，从而破坏病毒增殖的路径，但工业化生产的干扰素，在进行常规的检测时，其生物学活性往往偏低，其原因是缺乏干扰素诱导细胞时所需的蛋白酶等物质，导致干扰素未被充分活化，只有少部分能与易感细胞表面受体结合，从而最终导致抗病毒蛋白产量骤减。本专利技术加入的拉米夫定和黄芩，具备协同增效的作用，能够激活干扰素，刺激干扰素表达，从而提高干扰素的活性。
具体实施方式
[0021]以下具体说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围的前提下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围。
[0022]以下实施例中使用的试剂、质粒、培养基、宿主菌等生物原料均来自商业化产品。
[0023]实施例1猫干扰素标准品的制备
[0024]按照Genebank上公开的猫干扰素序列(Genebank号DQ420223)合成后，将该基因插入的pBV220温敏型重组质粒，然后导入DH5α大肠杆菌，在30℃、 200rpm培养20h，获得种子液；种子液以10％接种，42℃诱导6h，获得发酵液；发酵液经5000g、30min离心收获菌体；菌体经1000bar破碎，10000rpm、 30min离心收获包涵体；包涵体用含1％TritonX
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100的缓冲液洗涤3次，并用 2mol/L尿素溶解，获得500μg/ml蛋白的包涵体悬液；用2mol/L尿素稀释至100μg/ml，通过凝胶层析进行纯化，将稀释后的悬液上柱后采用pH梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经SDS
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PAGE检测，然后用pH8.0的磷酸盐缓冲溶液进行透析复性。复性后的蛋白浓度用考马斯亮蓝染色法测定。将复性后的干扰素进行冷冻干燥，制成标准品，标准品活性为10万单位/瓶。
[0025]实施例2.常规方法检测猫干扰素活性
[0026]采用微量细胞病变抑制法检测猫重组干扰素活性，用含有10％FBS的MEM 细胞培养基将细胞接种于96孔板中，于5％CO2，37℃培养至单层。分别加入倍比稀释的重组干扰素(实施例1制备的干扰素标准品)、猫干扰素样品1和2 (分别购自北京铁草科技有限公司和北京中科拜克生物技术有限公司)作用 18h，每孔再加入含100TCID
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的VSV病毒，同时设置阴性对照组，24h后观察细胞病变结果。同时设置不加干扰素的病毒对照组和不加干扰素及病毒的细胞对照组，待病毒对照组出现90％以上细胞病变时，进行结晶紫染色，测量 570nm时的波长。结果根据Reed
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Muench法计算。结果显示，自制标准品活性均高于样品1和2。
[0027]表1猫干扰素活性测定结果
[0028]分组活性万U/ml样品10.504样品22.943自制标准品10.007
[0029]实施例3不同检测体系检测猫干扰素活性
[0030]1.细胞毒性试验
[0031]将含有10％FBS的MEM细胞培养基，按40万/ml将细胞接种于96孔板中，于5％CO2，37℃培养4小时，加入重组干扰素(实施例1制备的干扰素标准品)，然后加入拉米夫定和黄芩，37℃培养24h；显微镜下观察细胞生长情况，加入药物后，细胞形态或生长速度发生改变，判为有细胞毒性，把未出现细胞毒性的最高浓度作为无细胞毒性浓度，进行后续试验。
[0032]结果显示，添加≤100μg/ml拉米夫定，添加≤300μg/ml黄芩，显示无细胞毒性，以此为最高剂量进行后续试验。
[0033]表2细胞毒性试验
[0034][0035]2.不同检测体系检测猫干扰素活性
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猫干扰素活性的检测方法，其特征在于，该检测方法添加了拉米夫定和黄芩。2.根据权利要求1所述的猫干扰素活性的检测方法，其特征在于，该检测方法选用了高糖型DMEM培养基进行培养。3.根据权利要求1所述的猫干扰素活性的检测方法，该检测方法包括：1)将含10％FBS的高糖型DMEM培养基铺96孔细胞板；2)培养4～6h后加入干扰素，同时加入拉米夫定和黄芩，37℃培养24h；3)弃...

【专利技术属性】
技术研发人员：李守军，王甜，苏建东，李睿，孙晨，车艳杰，刘海霞，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：