一种藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合基因、融合蛋白、重组质粒、转基因酿酒酵母及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合基因、融合蛋白、重组质粒、转基因酿酒酵母及应用。本发明专利技术将构建得到的线性rDNA2

【技术实现步骤摘要】
一种藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合基因、融合蛋白、重组质粒、转基因酿酒酵母及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合基因、融合蛋白、重组质粒、转基因酿酒酵母及应用。

技术介绍

[0002]降钙素(calcitonin，简称CT)是由32个氨基酸残基组成的一种多肽类激素，由鱼、鸟类等脊椎动物的后腮体或哺乳动物的甲状腺滤泡旁细胞(C细胞)分泌的。自从Copp等人1961年首次发现降钙素以来，人们对其分子结构和作用机理进行了广泛的研究。不同来源的降钙素氨基酸序列不同，但不同生物的降钙素对人都有活性，后鳃体来源的降钙素活性高于甲状腺来源的降钙素。目前在临床上以鲑鱼降钙素(salmon calcitonin，简称sCT)活性最高，是人降钙素(human calcitonin，简称hCT)活性的20～40倍。降钙素已经在临床上应用多年，主要用于预防和治疗老年性骨质疏松、Paget氏综合症、高钙血症等，并作为糖尿病、胃溃疡、急性胰肠炎等疾病的辅助治疗药物。目前降钙素已经开发上市的剂型只有注射和鼻喷给药两种，无口服给药剂型，临床使用最多的是化学合成的鲑鱼降钙素注射剂 (如密盖息、盖瑞宁等)。由于降钙素生物半衰期短，临床给药时间长达12个月以上，对于患者来说用药极为不便，且伴有额外的痛苦；并且生物当中的降钙素含量极微，而化学合成的降钙素产量低、造价昂贵且容易造成环境污染，极大地限制了降钙素的广泛使用。
[0003]随着基因工程技术的兴起和发展，利用高效的生物表达系统(原核表达系统和真核表达系统)制备廉价的降钙素成为可能。近二十年，国内外利用生物工程技术已经获得降钙素的多种表达方式。原核表达系统中外源蛋白产量高，生产周期短，但无法对外源蛋白进行转录后修饰，酰胺化工艺水平直接影响重组表达降钙素的活性，且细菌易产生热源和内毒素，不易除去，蛋白纯化工艺复杂，生产成本很高。真核表达系统可对外源蛋白进行酰胺化修饰，节约了生产成本，但外源基因的表达量普遍较低，生产周期较长、蛋白提取和纯化工艺更为复杂，限制了其在生产中的应用。并且降钙素分子太小，在溶液中极不稳定，真核表达系统仍无法避免蛋白提取、切割、纯化等烦琐的后续工作，严重影响目的蛋白的得率。所以，目前存在的问题迫切地要求发展一种更廉价更高效的真核表达系统。

技术实现思路

[0004]本专利技术为了解决目前降钙素在表达系统中的表达量低、需纯化、活性低、造价高及不能口服给药等一系列的问题，提供了一种藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合基因、融合蛋白、重组质粒、转基因酿酒酵母及应用。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合蛋白，是采用以下技术方案实现的。
[0006]一种藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
[0007]第二方面，本专利技术提供一种编码藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合蛋白的核酸序列，是采用以下技术方案实现的。
[0008]一种编码上述藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合蛋白的核酸序列，所述核酸序列如 SEQ ID NO.1所示。
[0009]进一步的，所述核酸序列的上游扩增引物如SEQ ID NO.7所示，下游扩增引物如SEQ ID NO.8所示。
[0010]第三方面，本专利技术提供一种重组质粒，是采用以下技术方案实现的。
[0011]一种重组质粒，包含上述编码藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合蛋白的核酸序列。
[0012]进一步的，所述重组质粒包括pgk基因启动子；所述pgk基因启动子的上游扩增引物如SEQ ID NO.9所示，下游扩增引物如SEQ ID NO.10所示。
[0013]进一步的，所述重组质粒包括leu2遗传选择标记基因；所述leu2遗传选择标记基因的上游扩增引物如SEQ ID NO.11所示，下游扩增引物如SEQ ID NO.12 所示。
[0014]进一步的，所述重组质粒包括rDNA1和rDNA2两个片段；所述rDNA1的上游扩增引物如SEQ ID NO.13所示，下游扩增引物如SEQ ID NO.14所示；所述rDNA2的上游扩增引物如SEQ ID NO.15所示，下游扩增引物如SEQ ID NO.16 所示。
[0015]第四方面，本专利技术提供一种酿酒酵母，是采用以下技术方案实现的。
[0016]一种酿酒酵母，保藏名称为：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae (BY4742
‑
LPB5)，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，保藏日期为：2020年12月25日，保藏编号为：CGMCC 21552。
[0017]第五方面，本专利技术提供一种酿酒酵母的制备方法，是采用以下技术方案实现的。
[0018]一种酿酒酵母BY4742
‑
LPB5的制备方法，包括以下步骤：
[0019](1)藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合基因的克隆：
[0020]将藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合基因(cpcB/5hsCT)进行PCR反应扩增，连入克隆载体pMD19
‑
T，构建重组质粒pMD19
‑
cpcB/5hsCT；
[0021](2)pgk基因启动子序列的克隆：
[0022]以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板，PCR反应扩增获得pgkpromoter 序列，连入克隆载体pMD19
‑
T，构建重组质粒pMD19
‑
pgkpromoter；
[0023](3)选择标记基因leu2的克隆：
[0024]以酿酒酵母YS(酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 1964)基因组DNA为模板，进行PCR反应扩增获得leu2基因，连入克隆载体pMD19
‑
T，构建重组质粒pMD19
‑
leu2；
[0025](4)rDNA片段的克隆：
[0026]以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板，分别进行PCR反应扩增获得 rDNA1和rDNA2两个片段，分别连入克隆载体pMD19
‑
T，构建重组质粒 pMD19
‑
rDNA1和pMD19
‑
rDNA2；
[0027](5)含cpcB/5hsCT融合基因表达质粒的制备：
[0028]首先将经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后的rDNA1片段插入到经相同内切酶消化的克隆载体pUC19，其次将经XbaⅠ和SacⅠ酶切后的cpcB/5hsCT插入到 rDNA1片段的上游，然后将经SalⅠ和XbaⅠ酶切后的pgkpromoter插入到cpcB/5hsCT的上游，再将用XhoⅠ和SalⅠ酶切后的leu2插入到pgkpromoter 的上游，最后将用SphⅠ和XhoⅠ酶切后的rDNA2片段插入到leu2的上游，
构建成pUC19
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种编码权利要求1所述藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合蛋白的核酸序列，其特征在于：所述核酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求2所述的编码藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合蛋白的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列的上游扩增引物如SEQ ID NO.7所示，下游扩增引物如SEQ ID NO.8所示。4.一种重组质粒，其特征在于：包含权利要求2所述的编码藻蓝蛋白/嵌合降钙素融合蛋白的核酸序列。5.根据权利要求3所述的一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包括pgk基因启动子；所述pgk基因启动子的上游扩增引物如SEQ ID NO.9所示，下游扩增引物如SEQ ID NO.10所示。6.根据权利要求3所述的一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包括leu2遗传选择标记基因；所述leu2遗传选择标记基因的上游扩增引物如SEQ ID NO.11所示，...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙恒一，董晓云，刘顺梅，陈家浩，王傑，张妍，李正，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：