异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母及其构建方法技术

本发明专利技术公开了异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母及其构建方法，其构建方法为：将优化后的糖基转移酶GTK1基因和优化后的糖基转移酶UGT1基因转入生产原人参二醇PPD的酿酒酵母，得到重组菌1；敲除重组菌1的二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因并过表达二酰甘油激酶DGK1基因，得到重组菌2，敲除重组菌2的β

【技术实现步骤摘要】
异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母及其构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母及其构建方法及应用。

技术介绍

[0002]人参皂苷F2(简称为F2)属于人参二醇型皂苷，是Rb1、Rb2、Rc和Rd等失去若干糖基代谢降解形成的次级皂苷之一，皂苷元的C
‑
3位和C
‑
20位均为Glc糖基。F2是一种白色粉末，在人参中含量极其微少，仅存在于人参茎叶皂苷中，但其在抑制肿瘤、抗氧化等方面具有突出的效果，且由于尺寸较小，亲水性好，细胞膜渗透性强，生物利用度高，在人体中的吸收利用率高达70％，在抑制肿瘤、细胞保护、抑制肥胖、抗炎症等医药领域前景优良。
[0003]虽然F2具有很高的药用价值，但由于天然产量很少，制备技术方面存在空白，因此利用合成生物学相关技术构建细胞工厂，通过生物法获取高纯度高产量的F2对医药研发和传统药食资源开发利用都具有重要意义。近年来，采用合成生物学技术异源合成了一些天然产物，但在微生物中高产量异源合成人参皂苷F2还未见报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。
[0007]本专利技术的第四个目的是提供第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法。
[0008]本专利技术的第五个目的是提供第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法。
[0009]本专利技术的第六个目的是提供第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法。
[0010]本专利技术的第七个目的是提供第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。
[0011]本专利技术的第八个目的是提供第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。
[0012]本专利技术的第九个目的是提供第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。
[0013]本专利技术的技术方案概述如下：
[0014]第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：
[0015]将优化后的糖基转移酶GTK1基因和优化后的糖基转移酶UGT1基因转入生产原人参二醇PPD的酿酒酵母，得到第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母；
[0016]所述优化后的糖基转移酶GTK1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.1所示；
[0017]所述优化后糖基转移酶UGT1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.2所示。
[0018]第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：
[0019]敲除上述第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因并过表达二酰甘油激酶DGK1基因，得到第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母；
[0020]所述二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.3所示；
[0021]所述二酰甘油激酶DGK1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.4所示。
[0022]第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：
[0023]敲除上述第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的β
‑
葡萄糖水解酶EGH1基因，过表达磷酸葡萄糖变位酶PGM1基因和UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因，得到第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母；
[0024]所述β
‑
葡萄糖水解酶EGH1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.5所示；
[0025]所述磷酸葡萄糖变位酶PGM1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.6所示；
[0026]所述UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.7所示。
[0027]第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法构建的第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。
[0028]第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法构建的第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。
[0029]第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法构建的第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。
[0030]第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。
[0031]第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。
[0032]第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。
[0033]本专利技术的优点：
[0034]本专利技术成功构建了三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。实验证明，本专利技术的异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵得到人参皂苷F2，重组菌1、2、3的人参皂苷F2产量依次为15.5mg/L，20.15mg/L与44.83mg/L。
附图说明
[0035]图1.酿酒酵母胞内代谢产物分析。其中A为F2标准品和重组菌1代谢产物液相图；B为F2标准品和重组菌1代谢产物中F2的质谱图。
具体实施方式
[0036]下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。
[0037]生产原人参二醇PPD的酿酒酵母，选用中国专利号201410735927.X，专利技术名称为：一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法及应用中实施例3获得的“合成原人参二醇的酵母菌株W3a”，在本案中简称“酿酒酵母W3a”。
[0038]其它包括达玛烯二醇合酶DS、原人参二醇合酶PPDS及细胞色素P450酶还原酶
YPD液体培养基，30℃，220rpm摇床进行复苏培养2h；将复苏好的离心管在4000rpm转速下离心3min，弃去上层培养基，再用1ml无菌水洗涤两次；最后向含有菌体的离心管中加入200μl的无菌水并混匀，涂布于缺尿嘧啶的SC培养基平板上，放置于30℃恒温培养箱中培养2天，待单菌落长出，筛选获得重组菌1。
[0050]实施例2第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母菌株(简称重组菌2)的构建方法
[0051]敲除重组菌1的二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因并过表达二酰甘油激酶DGK1基因获得重组菌2，所述二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述二酰甘油激酶DGK1的核苷酸序列以SEQ ID NO.4所示。
[0052](1)二酰甘油激酶DGK1基因表达模块构建
[0053]以酿酒酵母ATCC208352基因组为模板，
[0054]利用DGA1
‑
F(SEQ ID NO.22)
[0055]与TEF1
‑
DGA1
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：将优化后的糖基转移酶GTK1基因和优化后的糖基转移酶UGT1基因转入生产原人参二醇PPD的酿酒酵母，得到第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母；所述优化后日的糖基转移酶GTK1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.1所示；所述优化后糖基转移酶UGT1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.2所示。2.异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：敲除第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因并过表达二酰甘油激酶DGK1基因，得到第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母；所述二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.3所示；所述二酰甘油激酶DGK1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.4所示。3.异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：敲除第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的β
‑
葡萄糖水解酶EGH1基因，过表达磷酸葡萄糖变位...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢文玉，张传波，叶楠，田锦平，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：