一种双平台联用的外周血cfDNA碱基突变和甲基化检测的方法技术

本发明专利技术提出了一种双平台联用的外周血cfDNA碱基突变和甲基化检测的方法，通过使用适配Illumina因美纳二代测序平台和纳米孔测序平台的通用Y型接头设计，解决了样品起始量不足的现实条件下，如何获得有效的核酸突变信息和修饰信息的问题。连接Y型接头的核酸短片段文库直接使用二代平台测序，可获得片段化核酸的高准确率的突变信息；连接Y型接头的核酸短片段文库还可酶切处理后，通过露出的粘性末端连接，将碎片化的核酸连接成长片段(>1kb)通过纳米孔，大大提高纳米孔的利用率、有效读长和总体数据量，同时获取了片段化核酸的修饰信息。数据产出后利用接头上的标签设计可以将多样本数据进行拆分，可以实现检测通量成数量级增加，降低单样品的检测成本。降低单样品的检测成本。降低单样品的检测成本。

【技术实现步骤摘要】
一种双平台联用的外周血cfDNA碱基突变和甲基化检测的方法


[0001]本专利技术涉及DNA甲基化检测
，特别涉及一种双平台联用的外周血 cfDNA碱基突变和甲基化检测的方法。

技术介绍

[0002]循环肿瘤DNA(ctDNA)是实体肿瘤细胞凋亡或破裂而释放进入外周血液循环系统的游离基因片段，大小在0.18
‑
21kb，主要存在于血液、滑膜液和脑脊液等液体中。因此ctDNA携带着与其来源肿瘤DNA同样的基因缺陷，如点突变、重排、扩增、微卫星改变、表观遗传修饰等，可用作肿瘤DNA的替代来源。最近的研究表明，ctDNA通过启用非侵入性的“液体活检”(即可以对实体恶性肿瘤进行分子检测的血液检测)，具有癌症患者诊断，预后和监测标志的作用。
[0003]基因突变(Gene Mutation)是指基因组DNA分子发生一系列可遗传的变异现象，因其普遍存在于各类癌症当中而备受关注，基突变导致的相应蛋白异常表达是细胞信号通路调控异常而发生恶性转化的重要原因。随着液体活检技术的兴起，利用ctDNA检测基因突变并指导肿瘤的精准治疗已成为当下肿瘤研究领域的热点。
[0004]DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团(5mC)。它属于DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是公认地有希望早期检测癌症的生物标志物。高通量测序技术也被称作二代测序技术(Next
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Generation Sequencing,NGS)，同时由于高通量测序能对一个物种的基因组和转录组进行全面、细致的分析，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。我国市场占有率最高的是Illumina因美纳公司的测序仪，除此外还有少部分life 公司的Ion Torrent测序仪和华大基因的BGI测序仪。
[0005]纳米孔检测技术作为一个新型检测平台，与二代测序技术相比，具有长读长、直接读取修饰信息和实时数据生产并行分析的特点，在长片段核酸检测变异(包括但不限于插入缺失、倒位易位、基因融合、RNA异常剪切、RNA编辑等多种核酸相关变异)和修饰信息(包括但不限于甲基化、乙酰化等)检测方面比二代测序或其他测序技术有更明显优势。使用纳米孔测序技术产出甲基化位点数据，可提高5mC识别的准确率，实现5mC的精准检测，提供包含高精度位点和精确的位点甲基化丰度的全基因组甲基化图谱。
[0006]应用依赖ctDNA的“液体活检”对癌症患者诊断、预后和监测具有显而易见的优势。但是，循环肿瘤DNA(ctDNA)在外周血中含量极低。通常10mL 的采血量提取到的cell
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free DNA，不足以分别建库完成多平台联合检测，或者是低投入量导致检测结果准确度降低。
[0007]二代测序平台的应用已趋于普遍，配套建库试剂盒丰富，测序费用低廉。碱基分辨率高，可达到99.99％。应用二代测序平台检测DNA突变优势明显，但是在甲基化修饰的检测上有较明显的劣势。目前依赖二代测序平台的DNA甲基化检测方法主要有两种：重亚硫酸盐转化测序法和免疫沉淀测序法。重亚硫酸盐转化测序法将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶
后通过二代测序进行检测，但缺点是转化效率受限以及短读取测序对于基因组重复区域不能准确鉴定；免疫沉淀测序法能够检测DNA或RNA甲基化修饰，但达不到单碱基分辨率。
[0008]在纳米孔测序技术应用中，DNA单链通过纳米孔的速度(～500bp/秒)会对测序的精度和有效性造成较大影响，短片段(<500bp)的测序质量偏低或无法有效读取，所以直接将外周血中提取获得的cfDNA建库测序会导致数据质量过低或测序失败，直接导致该平台在cfDNA测序领域无法投入应用。已有研究人员发现，可将核酸短片段通过连接成长链后进行纳米孔测序，但是连接的片段单碱基准确度较低，只有90％左右。因此，通常检测DNA突变仍然建议使用二代测序平台完成。同时二代测序平台适配的建库和测序耗材价格上明显低于纳米孔测序平台。

技术实现思路

[0009]针对现有技术中的技术问题，专利技术人提供一种适配Illumina因美纳二代测序平台和纳米孔测序平台的通用接头(Adapter，ADT)及双平台联用的cfDNA碱基突变和甲基化检测方法。
[0010]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0011]本申请公开了一种双平台联用的外周血cfDNA碱基突变和甲基化检测的方法，包括如下步骤：
[0012]S1、处理外周血样品得到含有cfDNA片段化核酸的混合物；
[0013]S2、通过末端修复和连接反应在所述cfDNA片段化核酸的末端连接Y型接头；得到连接有所述Y型接头的cfDNA片段化核酸组成的文库；
[0014]S3、取一部分连接有所述Y型接头的片段化核酸组成的文库，进行Illumina 因美纳平台测序，检测核酸突变位点；
[0015]S4、取剩余连接有所述Y型接头的片段化核酸组成的文库，进行酶切处理产生粘性末端接头；
[0016]S5、对上述已完成酶切的文库进行纯化，纯化后直接进行粘性末端的连接；
[0017]S6、控制连接反应条件形成具有三代测序读长的连接产物，经纯化分选，得到符合纳米孔测序质控标准的长串联核酸片段，然后进行纳米孔建库和测序，所述长串联核酸片段包含线性连接的cfDNA片段化核酸序列和位于各cfDNA片段化核酸序列至少一个末端的Y型接头，所述cfDNA片段化核酸序列之间通过所述Y型接头连接。
[0018]作为优选，所述Y型接头在配对的5
’
端添加了磷酸基团修饰。
[0019]作为优选，所述步骤S4中，酶切处理使用的内切酶与Y型接头上的酶切位点相一致。
[0020]作为优选，所述Y型接头的长度为70～85bp。
[0021]作为优选，所述步骤S3中的Illumina因美纳平台测序可以是直接测序、扩增后测序或是针对特殊片段完成捕获后测序中一种。
[0022]作为优选，所述步骤3中取1/4的连接有所述Y型接头的片段化核酸组成的文库，所述步骤4中3/4的连接有所述Y型接头的片段化核酸组成的文库。
[0023]作为优选，所述步骤S6中cfDNA片段化核酸序列的长度为140～180bp，所述串联核酸片段的长度为1kb
‑
3kb。
[0024]作为优选，所述步骤S6中cfDNA片段化核酸序列是来源于相同或不同外周血cfDNA的片段化核酸。
[0025]本专利技术的有益效果：
[0026]1、本专利技术中使用的接头包含了酶切位点，可以通过酶切后再连接，将 cfDNA小片段从167bp左右连接到1kb左右，将使用cfDNA为模板的测序文库片段长度满足纳米纳米孔测序平台的上机需求。纳米孔平台可以直接通过测序识别DNA序列上的甲基化修饰，而不需要进行原始碱基的转化，相比常用的重亚硫酸盐转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双平台联用的外周血cfDNA碱基突变和甲基化检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、处理外周血样品得到含有cfDNA片段化核酸的混合物；S2、通过末端修复和连接反应在所述cfDNA片段化核酸的末端连接Y型接头；得到连接有所述Y型接头的cfDNA片段化核酸组成的文库；所述Y型接头包括标签序列、酶切位点、Illumina因美纳平台测序引物序列和flow cell结合序列；S3、取一部分连接有所述Y型接头的片段化核酸组成的文库，进行Illumina因美纳平台测序，检测核酸突变位点；S4、取剩余连接有所述Y型接头的片段化核酸组成的文库，进行酶切处理产生粘性末端接头；S5、对上述已完成酶切的文库进行纯化，纯化后直接进行粘性末端的连接；S6、控制连接反应条件形成具有三代测序读长的连接产物，经纯化分选，得到符合纳米孔测序质控标准的长串联核酸片段，然后进行纳米孔建库和测序，所述长串联核酸片段包含线性连接的cfDNA片段化核酸序列和位于各cfDNA片段化核酸序列至少一个末端的Y型接头，所述cfDNA片段化核酸序列之间通过所述Y型接头连接。2.如权利要求1所述的一种双平台联用的外周血cfDNA碱基突变和甲基化检测的方法，其特征在于：所述Y型接头在配对的5
’
端添加了磷酸基团修饰。3.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚慧捷，胡垚，毕亭亭，曹梦娇，聂彩依，吴贵江，
申请(专利权)人：浙江默乐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：