结直肠癌血液检测标记物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种结直肠癌血液检测标记物及其应用，属于肿瘤检测领域。本发明专利技术的结直肠癌血液检测标记物，为BEND5和TFPI2基因的组合，该标记物或其甲基化检测试剂可用于制备结直肠癌或癌前病变检测试剂盒。使用本发明专利技术的标记物对结直肠癌检测，具有很高的敏感性和特异性，在血浆样本中，BEND5和TFPI2甲基化组合检测对I/II期结直肠癌的敏感性大于71％，对III/IV期结直肠癌的敏感性大于89％，同时，该组合能有效避免胃癌和食管癌等其他消化道癌种产生的假阳性。本发明专利技术为结直肠癌的无创诊断提供了一种新思路。了一种新思路。

【技术实现步骤摘要】
结直肠癌血液检测标记物及其应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤检测领域，具体涉及结直肠癌血液检测标记物及其应用。

技术介绍

[0002]结直肠癌是我国乃至全世界最常见的恶性肿瘤之一，主要包括结肠癌与直肠癌两大类。国家癌症中心2019年发布的全国癌症统计数据显示，我国2015年结直肠癌的新发病例数为37.63万人，因结直肠癌死亡患者19.10万人，位于恶性肿瘤发病率第三位、死亡率第五位。结直肠癌的预后与疾病诊断时的严重程度相关，美国结直肠癌患者5年生存率为67％，而我国目前仅为31％。2004年至2013年，美国结直肠癌的发病率每年下降3％，整体死亡率平均每年下降2.7％，早期筛查在其中的贡献率超过50％。
[0003]散发性结直肠癌主要按照正常
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腺瘤
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癌的顺序和模式进展，早期发现可以显着降低死亡率。结肠镜检查是结直肠癌诊断的金标准，但由于肠道准备过程的侵入性和复杂性，其在平均风险人群中的依从性较低。粪便潜血试验(FOBT)和粪便免疫化学试验(FIT)是无创性的，但它们的敏感性不足，特别是对于I期结直肠癌和进展期腺瘤。由于结直肠癌在早期缺少症状，再加上民众癌症筛查意识薄弱以及对现有检测技术的排斥，我国结直肠癌的早期诊断率仅为10％左右，超过80％患者确诊时已到中晚期。
[0004]异常的DNA甲基化可能出现在结直肠癌发生的非常早期的阶段，到目前为止，已经确定了一些结直肠癌甲基化生物标志物，包括SDC2、NDRG4、BMP3、VIM、SFRP2和Septine9等。
[0005]虽然发现的标志物很多，但真正商品化的很少，第一个基于粪便的结直肠癌检测产品“Cologuard”，其检测靶标为血红蛋白、KRAS突变和两个甲基化基因(NDRG4和BMP3)，对结直肠癌的敏感性为92％，特异性为87％。研究显示，大众对于结直肠癌血液检测的接受度比结直肠癌粪便检测的接受度更高，目前已经商品化的血液检测标志物只有Septine 9，一项Meta分析(Diagnostic accuracy of methylated SEPT9 for blood
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based colorectal cancer detection:a systematic review and meta
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analysis.Clin Transl Gastroenterol.2017；8(1):e216.)结果显示，Septine 9对结直肠癌检测的整体灵敏性为72％，特异性为92％，当和FIT组合检测时，灵敏性提升到了94％，但特异性降到了68％，另外，Septine 9对于I期结直肠癌的灵敏性为45％，对于息肉的灵敏性为15％，导致其不太适合用于结直肠癌的筛查检测，因此需要进一步寻找适用于血液的甲基化标志物及其组合。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于解决现有结直肠癌血液检测效果不理想的问题，提供一种结直肠癌血液检测标记物及其应用。
[0007]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0008]一种结直肠癌血液检测标记物，其为BEND5和TFPI2基因的组合。
[0009]一种检测上述标记物甲基化水平的试剂，为检测BEND5和TFPI2基因甲基化水平的试剂。所述的甲基化水平的检测方法包括如下至少一种的方法：甲基化特异性PCR法、亚硫
酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量PCR法。
[0010]在一些实施方案中，所述的检测上述标记物甲基化水平的试剂，包含检测BEND5和TFPI2基因甲基化水平的引物和/或探针。进一步地，所述的试剂还包含检测内参基因甲基化水平的引物/或探针，所述的内参基因优选为ACTB基因。
[0011]在一些实施方案中，检测BEND5、TFPI2或ACTB基因甲基化水平的引物、探针的序列如下：
[0012]BEND5上游引物：GTAGCGCGTAGTAGACGTTGTT，
[0013]BEND5下游引物：CCCAACACCGTAACGAAACT，
[0014]BEND5探针：CGGGTTTCGGTCGGGTAGTTTAG；
[0015]TFPI2上游引物：TTAGGTTTCGTTTCGGCGG，
[0016]TFPI2下游引物：ACAACCCCAAAAAACGAACGAAATC，
[0017]TFPI2探针：TCTACTCCAAACGACCCGAATACC；
[0018]ACTB上游引物：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG，
[0019]ACTB下游引物：AATAACACCCCCACCCTGC，
[0020]ACTB探针：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG。
[0021]进一步地，上述探针为Taqman探针，其5
’
端有报告基团，3
’
端有猝灭基团。
[0022]上述标记物或试剂在制备结直肠癌或癌前病变检测试剂盒中的应用。优选地，所述的癌前病变为结直肠腺瘤，例如管状腺瘤、绒毛状腺瘤和绒毛管状腺瘤。在其他实施方式中，癌前病变还包括腺瘤病、炎症性肠病相关异型增生、传统锯齿状腺瘤和广基锯齿状腺瘤/息肉等。癌前病变包括不限于其他的肠道疾病。
[0023]一种结直肠癌或癌前病变检测试剂盒，包含上述试剂。
[0024]上述试剂、应用或试剂盒的检测样本为血液样本，包括全血、血清、血浆、血细胞。
[0025]本专利技术的优点和有益效果：专利技术人在前期的研究中发现ITGA4、ZNF829和BEND5这三个基因在结直肠癌组织样本中的甲基化水平显著高于正常组织样本，本专利技术进一步发现ITGA4和BEND5在血浆样本中对结直肠癌/癌前病变有很高的敏感性和特异性，单一基因甲基化检测对进展期腺瘤的敏感性大于50％，对结直肠癌的敏感性大于70％，特异性大于95％。进一步地，本专利技术发现将BEND5基因和TFPI2基因组合检测能有效提升敏感性，同时保持高特异性，在血浆样本中，BEND5和TFPI2甲基化组合检测对I/II期结直肠癌的敏感性大于71％，对III/IV期结直肠癌的敏感性大于89％，同时，该组合能有效避免胃癌和食管癌等其他消化道癌种产生的假阳性，具有很高的特异性。本专利技术为结直肠癌的无创诊断提供了一种新思路。
具体实施方式
[0026]以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制，其他的任何未背离本专利技术的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本专利技术的保护范围之内。
[0027]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0028]实施例1
[0029]1、DNA模板的提取：
[0030]当所用样本是全血样本时，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结直肠癌血液检测标记物，其特征在于：所述的标记物为BEND5和TFPI2基因的组合。2.一种检测权利要求1所述的标记物甲基化水平的试剂。3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述的甲基化水平的检测方法包括如下至少一种的方法：甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量PCR法。4.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：包含检测BEND5和TFPI2基因甲基化水平的引物和/或探针。5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于：还包含检测内参基因甲基化水平的引物/或探针。6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于：所述的内参基因为ACTB基因。7.根据权利要求4或6所述的试剂，其特征在于：检测BEND5、TFPI2或ACTB基因甲基化水平的引物、探针的序列如下：BEND5上游引物：GTAGCGCGTAGTAGACGTTGTT，BEND5下游引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：林军，张良禄，卢长明，
申请(专利权)人：武汉艾米森生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：