本发明专利技术公开了一种谷氨酰胺合成酶突变体及其应用，所述谷氨酰胺合成酶突变体包含突变位点V197W、A250F、R324K，所述谷氨酰胺合成酶突变体对谷氨酰胺合成酶抑制剂MSX的亲和力增强，且其本身的酶活性相对减弱，该谷氨酰胺合成酶突变体不仅有利于细胞保持较佳的生长状态，而且有利于MSX加压筛选过程中快速获取多拷贝稳定整合、高表达目的蛋白的细胞株，具有良好的应用价值。良好的应用价值。良好的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种谷氨酰胺合成酶突变体及其应用
[0001]本专利技术属于生物医药
，具体地，本专利技术涉及一种谷氨酰胺合成酶突变体及其应用，更具体地，本专利技术涉及一种包含V197W、A250F、R324K突变位点的谷氨酰胺合成酶突变体。
技术介绍
[0002]谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）是生物体中最古老、存在最广泛的酶（Kumada Y, Benson D R, Hillemann D, et al. Evolution of the glutamine synthetase gene, one of the oldest existing and functioning genes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1993, 90(7): 3009
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3013.），其参与许多生物体中的氮代谢和碳代谢。GS是生物体氮代谢的关键酶之一，而氮的同化作用是生物体维持生命所必需的，因此，GS及其基因在细菌、真菌、植物体中得到了广泛的研究。由于其生物学功能，GS基因常用作基因工程（基因靶向修饰和基因随机整合）的阳性选择标记。GS催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，这是在哺乳动物体内形成谷氨酰胺的唯一途径，在不含谷氨酰胺的培养基中，GS对哺乳动物细胞的存活是必不可少的。
[0003]生物药开发是一个非常复杂的过程，而构建适用于工业生产的高表达的细胞株是其关键的步骤之一。CHO细胞的GS筛选系统是目前工业上应用最为广泛的筛选系统。CHO细胞的GS筛选系统主要有以下优势：CHO细胞遗传背景清楚，很少分泌内源蛋白，有利于外源蛋白的分离纯化，GS筛选系统产量高。CHO细胞内源的GS活性比较低，无法表达足够的谷氨酰胺维持细胞快速生长，必须在培养基中添加外源的谷氨酰胺。GS抑制剂甲硫氨酸砜亚胺（Methionine sulfoximine，MSX）可用于抑制内源性GS的活性，用含目的基因和GS基因标记的表达载体，转染宿主CHO细胞，通过MSX加压筛选，促使GS基因和目的蛋白基因扩增，只有转染了额外GS基因的细胞才可以在不含有谷氨酰胺的培养基中生长，从而筛选获得重组表达细胞株。
[0004]目前，CHO细胞的GS筛选系统主要存在以下问题：高浓度的GS抑制剂MSX会对CHO细胞产生毒害作用，进而严重影响筛选得到的CHO稳转细胞株的生长状态，MSX加压筛选过程相对较长。鉴于此，本专利技术提供了一种新型的GS突变体，所述GS突变体对GS抑制剂MSX的亲和力增强，且其本身的酶活性相对减弱，该GS突变体不仅有效降低了在CHO稳转细胞株筛选过程中GS抑制剂MSX的使用量，而且有利于MSX加压筛选过程中快速获取多拷贝稳定整合、高表达目的蛋白的细胞株，目前尚未有本专利技术所述的GS突变体的相关报道。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于提供一种谷氨酰胺合成酶突变体及其应用，以克服目前本领域CHO细胞GS筛选系统存在的上述技术问题。
[0006]本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实现：本专利技术的第一方面提供了一种谷氨酰胺合成酶突变体。
[0007]进一步，所述谷氨酰胺合成酶突变体由野生型谷氨酰胺合成酶的第197位、第250位和第324位氨基酸发生突变得到的；所述第197位、第250位和第324位氨基酸发生的突变分别为V197W、A250F和R324K。
[0008]进一步，所述第197位氨基酸发生的突变为第197位的缬氨酸(V)突变为色氨酸(W)。
[0009]进一步，所述第250位氨基酸发生的突变为第250位的丙氨酸(A)突变为苯丙氨酸(F)。
[0010]进一步，所述第324为氨基酸发生的突变为第324位的精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)。
[0011]进一步，本专利技术中所述的“AxxxB”是指第xxx位的氨基酸A突变为氨基酸B，例如“V197W”表示第197位的氨基酸V突变为W，以此类推。例如，V197W表示相对于野生型的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列而言，第197位的缬氨酸(V)被色氨酸(W)所取代，A250F表示相对于野生型的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列而言，第250位的丙氨酸(A)被苯丙氨酸(F)所取代，R324K表示相对于野生型的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列而言，第324位的精氨酸(R)被赖氨酸(K)所取代，对于存在双重或多重突变位点的突变体，各突变位点之间以“、”隔开，例如，V197W、A250F、R324K表示相对于野生型的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列而言，第197位的缬氨酸(V)被色氨酸(W)所取代、第250位的丙氨酸(A)被苯丙氨酸(F)所取代、第324位的精氨酸(R)被赖氨酸(K)所取代，上述三个突变均存在于所述具体的谷氨酰胺合成酶突变体内。
[0012]进一步，所述野生型谷氨酰胺合成酶的来源为人、狗或CHO。
[0013]进一步，所述CHO为中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamsters ovary，CHO），所述CHO细胞中存在谷氨酰胺合成酶，但是其活性比较低，无法表达足够的谷氨酰胺维持细胞的快速生长，必须在培养基中添加外源的谷氨酰胺。
[0014]在本专利技术的具体实施例中，专利技术人通过CHO谷氨酰胺合成酶结构预测和突变体预测得到了在人、狗、CHO野生型谷氨酰胺合成酶中存在的有可能同时影响CHO谷氨酰胺合成酶与MSX或ADP/ATP亲和力的8个位点，所述8个位点分别为V197、Q201、Q205、A250、G251、H304、T306和R324，更进一步地，对上述预测得到的在人、狗、CHO野生型谷氨酰胺合成酶中存在的8个位点进行了序列比对，结果显示上述8个位点在人、狗、CHO野生型谷氨酰胺合成酶中是完全相同的。
[0015]进一步，所述序列比对的方法可使用Blast网站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行Protein Blast比对；采用本领域技术人员熟知的其他序列比对方法或工具也可以得到相同的结果。
[0016]进一步，所述谷氨酰胺合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:24所示。
[0017]进一步，本专利技术中所述谷氨酰胺合成酶突变体还包括与SEQ ID NO:2具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的氨基酸序列所对应的谷氨酰胺合成酶突变体，且其功能包括与氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:24所示的谷氨酰胺合成酶突变体相当或略有下降或略有提高或大幅提高等，上述谷氨酰胺合成酶突变体也均包含在本专利技术的保护范围内。
[0018]进一步，本专利技术中所述的“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性，所述“同一性”同“同源性”。可通过比较各序列中可为比较目的而比对的位置来测定同一性。当所比较序列中的一个位置本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，所述谷氨酰胺合成酶突变体由野生型谷氨酰胺合成酶的第197位、第250位和第324位氨基酸发生突变得到；所述第197位、第250位和第324位氨基酸发生的突变分别为V197W、A250F和R324K。2.根据权利要求1所述的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，所述野生型谷氨酰胺合成酶的来源为人、狗或CHO。3.根据权利要求1所述的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，所述谷氨酰胺合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:24所示。4.根据权利要求3所述的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，所述谷氨酰胺合成酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。5.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1
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4任一项所述的谷氨酰胺合成酶突变体。6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求5所述的核酸分子。7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁晓然，缪仕伟，谈彬，吕明，
申请(专利权)人：杭州尚健生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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