使用了病毒的循环肿瘤细胞的检测方法技术

[问题]检测循环肿瘤细胞的方法的提供。[解决手段]一种检测循环肿瘤细胞的方法，其包含以下的步骤：(a)在红细胞与白细胞的交联剂存在下对血液样品进行密度梯度离心处理而制备除去了血细胞的被检样品的步骤；(b)在步骤(a)中制备的被检样品中，使病毒进行感染的步骤；(c)对步骤(b)中得到的被检样品进行标记的步骤；以及(d)从步骤(c)中得到的被检样品中，检测循环肿瘤细胞的步骤。检测循环肿瘤细胞的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用了病毒的循环肿瘤细胞的检测方法


[0001]本专利技术涉及使用了病毒的循环肿瘤细胞的检测方法。

技术介绍

[0002]在外周血中循环的癌细胞(Circulating Tumor Cell；CTC)是离开实体肿瘤病灶，与血液一同在体内循环的癌细胞，与以往的肿瘤标记相比，有望成为更锐敏的癌早期诊断生物标记物。
[0003]端粒酶是参与细胞的永生化的酶，其在所有的癌细胞中都高度地活化。OBP
‑
401(TelomeScan)是搭载有人类端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子以及GFP基因的基因编辑腺病毒(专利文献1:WO 2006/036004)。并且，使用该OBP
‑
401简便地检测CTC的方法正在被开发(非专利文献1：Kojima T.,et al,J.Clin.Invest.,119；3172,2009)。
[0004]在该方法中，由于其感染癌细胞并增殖、而端粒酶活性依赖性地大量表达GFP，因此能够不依赖于细胞表面抗原而捕捉所有类别的“活着的”CTC。例如，即使是以下这样的CTC也能够检测到：发生了上皮间质转化(Epithelia l
‑
Mesenchymal Transition；EMT)而使细胞表面抗原的表达的程度或有无发生了变化的CTC，其无法被以CellSearch
TM
为代表的、利用上皮细胞标记的以往的CTC检测法检测到。该EMT
‑
CTC与癌干细胞的关联性强，被认为具有治疗抵抗性且恶性度高(非专利文献2：Science.2013Yu M et al.)，近年来作为重要的生物标记物而受到瞩目。
[0005]然而，在使用了OBP
‑
401的CTC检测法中的以往的血液预处理方法中，是将血液中的红细胞溶解后，通过离心分离除去红细胞残渣，由此对CTC进行浓缩的(非专利文献1)。
[0006]然而，在用以往的血液预处理方法浓缩CTC后利用OBP
‑
401进行CTC检测的情况下，依然存在以下的问题：虽然对添加至血液中的癌细胞株具有极高的灵敏度，能够以高特异度进行检测，但实际想要从癌患者处采集的血液样品(以下，称为“临床检体”)中检测CTC时，灵敏度以及特异度会降低。
[0007]此外，非专利文献3的第4页公开了一般的CTC检测方法中的多种血液预处理方法以及其问题，其公开了：在使用了RosetteSep
TM
的血液预处理方法中，由于使用以多个细胞表面蛋白为靶标的抗体混合物，因此会在除去血细胞的同时连CTC一同除去，而使CTC的回收率降低。
[0008]此外，在使用了病毒的CTC检测方法中适用的血液预处理方法，特别是，就适宜用于从临床检体中检测CTC的血液预处理方法而言，目前为止还未被发现。
[0009]现有技术文献
[0010]专利文献
[0011]专利文献1：WO 2006/036004
[0012]非专利文献
[0013]非专利文献1：Kojima T.,et al,J.Clin.Invest.,119；3172,2009
[0014]非专利文献2：Science.2013Yu M et al.
[0015]非专利文献3：Scientific reports.2016 07 19；6；28929

技术实现思路

[0016]本专利技术所解决的技术问题
[0017]如上所述，就使用了病毒的循环肿瘤细胞的检测方法而言，需要开发一种从临床检体中也能够以高灵敏度、高特异度检测CTC的方法。
[0018]解决技术问题的技术手段
[0019]本专利技术者为了解决所述问题而进行了深入研究，结果发现：在使用了病毒的循环肿瘤细胞的检测方法中，通过使用给定试剂从血液样品中分离红细胞以及白细胞，可以在除去血细胞的同时增加检测出的CTC的数量，其结果，即使在临床检体中也能够提高灵敏度以及特异度这两者，从而完成了本专利技术。
[0020]即，本专利技术如下：
[0021][1][0022]一种检测循环肿瘤细胞的方法，其包含以下的步骤：
[0023](a)在不与循环肿瘤细胞结合而与循环肿瘤细胞以外的细胞(非循环肿瘤细胞)结合的试剂的存在下，对血液样品进行密度梯度离心处理而制备除去了所述非循环肿瘤细胞的被检样品的步骤；
[0024](b)在步骤(a)中制备的被检样品中，使病毒进行感染的步骤；
[0025](c)对步骤(b)中得到的被检样品进行标记的步骤；以及
[0026](d)从步骤(c)中得到的被检样品中，检测循环肿瘤细胞的步骤。
[0027][2][0028][1]所述的方法，其中，
[0029]病毒为进行肿瘤细胞特异性增殖的病毒。
[0030][3][0031][2]所述的方法，其中，
[0032]进行肿瘤细胞特异性增殖的病毒为由端粒酶逆转录酶启动子控制的重组病毒。
[0033][4][0034][1]～[3]中任一项所述的方法，其中，
[0035]病毒包含荧光蛋白基因。
[0036][5][0037][1]～[4]中任一项所述的方法，其中，
[0038]与非循环肿瘤细胞结合的试剂为与白细胞结合的试剂。
[0039][6][0040][1]～[5]中任一项所述的方法，其中，
[0041]在步骤(a)中，白细胞的80～90％被除去。
[0042][7][0043][5]所述的方法，其中，
[0044]与白细胞结合的试剂为红细胞与白细胞的交联剂。
[0045][8][0046][7]所述的方法，其中，
[0047]红细胞与白细胞的交联剂为双重以上的特异性抗体。
[0048][9][0049][7]所述的方法，其中，
[0050]红细胞与白细胞的交联剂为双特异性抗体。
[0051][10][0052][9]所述的方法，其中，
[0053]双特异性抗体包含四聚体的抗体。
[0054][11][0055][8]～[10]中任一项所述的方法，其中，
[0056]双重以上的特异性抗体为针对CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD56、CD61、CD66b或血型糖蛋白A的抗体。
[0057][12][0058][8]～[10]中任一项所述的方法，其中，
[0059]双重以上的特异性抗体为针对CD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD66b或血型糖蛋白A的抗体。
[0060][13][0061][7]～[12]中任一项所述的方法，其中，
[0062]红细胞与白细胞的交联剂为RosetteSep
(TM)
。
[0063][14][0064][13]所述的方法，其中，
[0065]RosetteSep...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种检测循环肿瘤细胞的方法，其包含以下的步骤：(a)在不与循环肿瘤细胞结合而与循环肿瘤细胞以外的细胞(非循环肿瘤细胞)结合的试剂的存在下，对血液样品进行密度梯度离心处理而制备除去了所述非循环肿瘤细胞的被检样品的步骤；(b)在步骤(a)中制备的被检样品中，使病毒进行感染的步骤；(c)对步骤(b)中得到的被检样品进行标记的步骤；以及(d)从步骤(c)中得到的被检样品中，检测循环肿瘤细胞的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中，病毒为进行肿瘤细胞特异性增殖的病毒。3.根据权利要求2所述的方法，其中，进行肿瘤细胞特异性增殖的病毒为由端粒酶逆转录酶启动子控制的重组病毒。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，病毒包含荧光蛋白基因。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，与非循环肿瘤细胞结合的试剂为与白细胞结合的试剂。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中，白细胞的80～90％被除去。7.根据权利要求5所述的方法，其中，与白细胞结合的试剂为红细胞与白细胞的交联剂。8.根据权利要求7所述的方法，其中，红细胞与白细胞的交联剂为双重以上的特异性抗体。9.根据权利要求7所述的方法，其中，红细胞与白细胞的交联剂为双特异性抗体。10.根据权利要求9所述的方法，其中，双特异性抗体包含四聚体的抗体。11.根据权利要求8～10中任一项所述的方法，其中，双重以上的特异性抗体为针对CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD56、CD61、CD66b或血型糖蛋白A的抗体。12.根据权利要求8～10中任一项所述的方法，其中，双重以上的特异性抗体为针对CD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD66b或血型糖蛋白A的抗体。13.根据权利要求7～12中任一项所述的方法，其中，红细胞与白细胞的交联剂为RosetteSep
(TM)
。14.根据权利要求13所述的方法，其中，RosetteSep
(TM)
的添加量为每3mL血液20～35μL。15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其中，密度梯度离心用含有FCS和EDTA的缓冲液进行。16.根据权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)、步骤(b)以及步骤(c)中的至少1个步骤中包含清洗细胞的步骤，至少1次的
清洗细胞的步骤用含有FCS和EDTA的缓冲液进行。17.根据权利要求1～16中任一项所述的方法，其中，在步骤(d)中，在检测循环肿瘤细胞之前，包含将被检样品供给至网眼为50～200μm的尼龙过滤器的步骤。18.根据权利要求1～17中任一项所述的方法，其中，在步骤(d)中，包含被检样品的溶液包含水溶性封入剂。19.根据权利要求1～18...

【专利技术属性】
技术研发人员：冈部隆宏，十合晋作，高桥和久，阿部可奈惠，浦田泰生，
申请(专利权)人：癌康理生物制药株式会社，
类型：发明
国别省市：