一种重组抗EGFR单克隆抗体的制剂制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种重组抗EGFR单克隆抗体的制剂。本发明专利技术提供了一种重组抗EGFR单克隆抗体的制剂，该制剂提高了重组抗EGFR单克隆抗体的稳定性，改善了重组抗EGFR单克隆抗体的临床效果，具有良好的应用前景和广泛的应用价值。景和广泛的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种重组抗EGFR单克隆抗体的制剂


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种重组抗EGFR单克隆抗体的制剂。

技术介绍

[0002]表皮生长因子受体（EGFR）是转移性结直肠癌（mCRC）的重要治疗靶点，在EGFR胞外段与配体（如表皮生长因子EGF）结合后，将发生二聚体化，然后是酪氨酸残基的自磷酸化作用，进一步刺激Ras蛋白，导致磷酸化级联反应的发生和丝裂原激活蛋白（MAP）激酶的激活，或者转录信号传导和激活、磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K）-Akt和应激活化蛋白激酶（SAPK）信号传导通路将被激活。这些信号通路依次触发基因转录，同时控制细胞增生、分化和生存的通路被激活。
[0003]EGFR靶向药物作用于EGFR胞外区域，抑制下游RAS-RAF-MEK-ERK通路，从而发挥抑制癌细胞增殖等抗癌作用。临床应用表明，西妥昔单抗、帕尼单抗等EGFR靶向药物对近十几年来结直肠癌患者生存期和生活质量的改善做出了重要的贡献。
[0004]然而由于EGFR在正常组织也有一定水平的表达，因此EGFR靶向药物仍然存在一定的副反应，虽然与化疗比相对较轻。
[0005]CMAB009（专利申请号CN201510006233.7）是一种采用特定方法制备的重组抗EGFR嵌合单克隆抗体，动物试验和初步的临床研究表明对转移性结直肠癌有潜在的治疗效果。

技术实现思路

[0006]为了进一步提高重组抗EGFR单克隆抗体CMAB009的稳定性，并改善重组抗EGFR单克隆抗体尤其是CMAB009的临床效果，本专利技术提供了一种技术方案，具体如下：一种的重组抗EGFR单克隆抗体的制剂配方，尤其适用于CMAB009抗体，含有以下的组分：重组抗EGFR单克隆抗体，2 mg/mL；磷酸二氢钠
·
一水，0.41 mg/mL；磷酸氢二钠
·
七水，1.88 mg/mL；聚山梨酯80（PEG80），0.1 mg/mL；丙氨酰谷氨酰胺，35 mg/mL。
[0007]所述的CMAB009抗体采用专利申请号CN201510006233.7所述的制备方法生产制备，具体而言具有SEQ ID NO: 1所述核苷酸序列编码的轻链及SEQID NO:3所述核苷酸序列编码的重链，更具体而言具有SEQ ID NO: 2所述氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO: 4所述氨基酸序列的重链，轻链和重链之间通过二硫键连接。
[0008]所使用的溶剂是水，应达到注射用水的质量标准。
[0009]所述的辅料磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、聚山梨酯80、丙氨酰谷氨酰胺等的生产过程和质量管理应符合行政机构对药用辅料或药品的要求，达到中国药典规定的质量标准。
[0010]所述的制剂配方适用于静脉注射的给药方式。
[0011]本专利技术的有益效果是，能够显著提高所述的重组抗EGFR单克隆抗体的储存稳定性，减少储存过程中聚集体和电荷异质体的产生，同时增强重组抗EGFR单克隆抗体的疗效，尤其是在延长生存期方面有潜在的优势。
附图说明
[0012]图1 酶联免疫法检测储存后的不同制剂配方的CMAB009对EGFR的亲和性的实验结果；图2 动物试验检测不同制剂配方的CMAB009对小鼠肿瘤的抑制效果的结果；图3 动物试验检测不同制剂配方的CMAB009对荷瘤小鼠生存期延长效果的结果。
具体实施方式
[0013]实施例1、重组抗EGFR单克隆抗体的制剂配方将重组抗EGFR单克隆抗体CMAB009（CN201510006233.7）按表1所示配方溶解于水溶液中，形成注射液制剂，用于静脉注射。
[0014]表1 CMAB009的制剂配方该制剂配方的实现方法：将含有CMAB009的细胞培养液通过一系列层析、过滤等步骤进行纯化、除病毒后，将获得的含有目的蛋白的溶液浓缩，然后透析、稀释，配制入按照上述配方配置的缓冲液中。
[0015]实施例2、不同制剂配方对CMAB009抗体稳定性的影响将CMAB009分别按照表1和表2的制剂配方（表2为参比配方，系CMAB009和西妥昔单抗的原始制剂配方）制成制剂，在4℃放置90天，然后分别用反相层析（RP-HPLC）、分子排阻层析（SE-HPLC）、阳离子交换层析（CEX-HPLC）分析溶液中的蛋白分布情况，并以未经45℃温育的初始样品作为对照。
[0016]表2 CMAB009的参比制剂配方
层析方法如下：（1）反相层析用Waters UPLC系统和Waters C4层析柱（2.1 x 50 mm, 1.7
ꢀµ
m）进行反相色谱，流动相为含0.1%甲酸、梯度浓度从25%到35%的含水乙腈，流速0.4 mL/min，温度为60℃，检测波长280 nm。具有最大面积和高度的峰被确定为主峰。
[0017]（2）分子排阻层析用Waters UPLC系统和Waters ACQUITY UPLC Protein BEH200 SEC 4.6
×ꢀ
150 mm排阻层析柱进行分子排阻色谱，流动相采用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（加15%异丙醇），流速0.5 mL/min，上样量10 μL浓度为1.0 mg/mL的蛋白样品，检测波长280 nm。具有最大面积和高度的峰被确定为天然单体峰，在其之前检测到的峰为聚集体峰。使用以下公式计算目标峰的峰面积比：目标峰的峰面积比（%）＝100
×
（目标峰的峰面积）/（目标峰的峰面积+其他峰总峰面积）（3）离子交换层析用Waters UPLC系统和MabPac SCX-10（4 mm
×
250 mm）分析柱进行阳离子交换色谱，流动相A为pH6.0的20 mmol/L磷酸盐缓冲液，流动相B为含有100 mmol/L氯化钠的pH6.0的20 mmol/L磷酸盐缓冲液，流速1.0 mL/min，柱温40℃，检测波长280 nm。具有最大面积和高度的峰被确定为主峰，并且在主峰之后检测到的峰统称为酸性峰，之前的峰为碱性峰。计算所有峰的峰面积，并使用以下公式计算目标峰的峰面积比：目标峰的峰面积比（%）＝100
×
（目标峰的峰面积）/（目标峰的峰面积+其他峰的总峰面积）。
[0018]层析分析结果列示在表3。
[0019]表3 不同制剂配方对CMAB009抗体稳定性的影响结果表明，从聚集体和电荷异质体形成情况来看，使用表1的制剂配方所获得的保存效果明显优于表2的制剂配方。
[0020]实施例3、酶联免疫法检测储存后的CMAB009的抗原亲和性采用ELISA的方法检测实施例2中的CMAB009制剂样品对靶抗原EGFR的亲和性。
[0021]ELISA检测方法如下：在 96 孔酶标板上包被溶于 PBS（磷酸盐缓冲液，pH=6.80）中的EGFR-Fc 重组蛋白（张江生物技术公司），重组蛋白包被浓度为500 ng/mL，使用含有10%脱脂奶粉的PBS进行封闭。在室温下，使用经梯度稀释的待检抗体孵育1小时。接下来，在37℃条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组抗EGFR单克隆抗体的制剂，其特征是，含有以下组分：重组抗EGFR单克隆抗体，2 mg/mL；磷酸二氢钠
·
一水，0.41 mg/mL；磷酸氢二钠
·
七水，1....

【专利技术属性】
技术研发人员：王皓，陶静，张大鹏，李晶，钱卫珠，李继阳，张浔敏，李伟，杨立敏，
申请(专利权)人：泰州迈博太科药业有限公司，
类型：发明
国别省市：