一种李子叶片组培快繁的接种方法技术

本发明专利技术公开了一种李子叶片组培快繁的接种方法，属植物组培技术领域。在雨季取健康、表皮毛少的李子嫩叶的基部，用质量浓度75％的酒精密闭消毒，无菌水漂洗1次，接种至培养基中暗培养，接种第30d污染率为1.7％、褐化率8.3％，褐死率为0，膨大率和愈伤组织诱导率均为98.3％，愈伤生长良好。本发明专利技术采用消毒前不水洗且切成小块后消毒的方法减少污染，用75％的酒精消毒避免了用剧毒试剂升汞和刺激性、氧化性强的次氯酸钠；操作简单、省时省力省水省洗涤剂省试剂省成本、安全环保，提高了接种质量和效率，为李子再生体系建立、进行瞬时表达鉴定基因功能、转基因及基因编辑培育新种质奠定了基础，适于科研和工厂化的组培领域。适于科研和工厂化的组培领域。适于科研和工厂化的组培领域。

【技术实现步骤摘要】
一种李子叶片组培快繁的接种方法


[0001]本专利技术涉及植物组织培养
，更具体的说是涉及一种李子叶片组培快繁的接种方法。

技术介绍

[0002]植物组织培养技术被广泛应用于植物快繁、遗传转化、基因编辑、生产次生代谢产物、种质保存等领域，其在科学研究与生产应用上的地位尤为重要。在组织培养过程中，外植体接种是植物从大自然环境中进入组织培养流程的第一个必经且重要的环节。嫩叶是组织培养常用的外植体，常通过叶片再生途径获得转基因植株和基因编辑的新种质。已有研究表明，李子嫩叶作外植体时的接种流程通常为选择春季嫩叶
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整叶用洗涤剂清洗和流水冲洗
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升汞溶液或者是次氯酸钠溶液消毒
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用无菌水漂洗3～5次
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用质量浓度75％的酒精溶液消毒
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无菌水漂洗3～5次
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超净台内剪切成小块儿
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接种到培养基上培养
→
获得愈伤组织等。
[0003]按照上述传统的接种方法，接种李子叶片时存在如下问题：(1)因为7～8月雨季是易污染的季节，故现有技术通常用春季新梢的嫩叶作为外植体，但有时需要在容易污染的雨季接种李子叶片，目前，缺少相关技术；(2)现有技术是消毒前用洗涤剂洗涤叶片几至几十分钟、流水冲洗0.5至几小时，费洗涤剂费水费时；(3)现有技术是用酒精结合次氯酸钠消毒或酒精结合升汞消毒，为了保证消毒彻底，通常消毒时间长、浓度高，每种消毒剂消毒后均需用无菌水漂洗3～5次，即总共用无菌水漂洗6～10次，费水费时；另外，升汞对植物、动物、环境而言都是剧毒，次氯酸钠有很强的刺激性气味、氧化性、腐蚀性，而李子嫩叶薄，消毒时易被升汞和次氯酸钠所伤，导致接种后叶片褐化甚至死亡，从而使接种后的材料无法继续培养造成材料、时间及成本上的损失。综上可知，现有的接种李子叶片的技术，费时、费力、费水、费洗涤剂、费试剂、成本高、对环境有污染、对操作者存在安全风险，存在增加生产和科研的成本甚至带来严重损失的风险。
[0004]因此，提供一种即便是在7～8月易污染的雨季仍可接种、消毒前不用洗涤剂清洗和水洗、不用升汞和次氯酸钠消毒、减少无菌水漂洗次数、操作简单、高效优质、安全环保的李子叶片组培快繁的接种方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种李子叶片组培快繁的接种方法，是一种即便是在7～8月易污染的雨季仍可接种、消毒前不用洗涤剂清洗和水洗、不用升汞和次氯酸钠消毒、减少无菌水漂洗次数、接种叶片基部的高效优质的接种方法。采用本专利技术方法叶片在接种后污染率低、正常膨大且生长出愈伤组织。达到省时省力省水省洗涤剂省试剂省成本、操作简单、安全环保、优质高效完成李子叶片接种环节的目的。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种李子叶片组培快繁的接种方法，具体步骤如下：
[0008](1)剪取李子叶片的基部；
[0009](2)将李子叶片基部用质量浓度75％的酒精消毒，无菌水漂洗；
[0010](3)将漂洗后的叶片接种至培养基中暗培养。
[0011]一般来说，接种成功的标准是看叶片的污染、褐化、褐死、膨大和长出愈伤组织的情况。首先，本专利技术技术方案的理论基础是：即便是容易污染的7～8月的雨季，无机械损伤的、健康叶片的内部也是没有菌的，所以做好叶片表面的消毒即可；因此，本专利技术技术方案仅用质量浓度为75％的酒精溶液消毒叶片即可，不必如传统方法一样使用强度较大的酒精溶液加升汞溶液或酒精溶液加次氯酸钠溶液消毒方法。其次，本领域技术人员一般采用洗涤剂清洗和长时间流水冲洗的方法以降低接种后的污染率，费洗涤剂费水费时；本专利技术摒弃了现有叶片作外植体的接种方法中消毒前先用洗涤剂清洗、再用流水冲洗、然后用升汞加酒精溶液或次氯酸钠加酒精溶液消毒、无菌水共漂洗6～10次的传统方法，突破了传统思路的禁锢，采用消毒前无需用洗涤剂清洗、无需水洗、仅用酒精溶液消毒、消毒后无菌水漂洗的方法，达到了比传统接种方法还好的接种效果，并且能够降低漂洗次数。第三，现有技术为了降低污染一般是将完整的李子嫩叶在超净工作台内消毒、在不区分叶片部位的情况下将其剪切成0.5～1.0cm2的小块儿，这就需要在超净台内用高温消毒的解剖刀或剪刀结合高压灭菌后的滤纸进行，操作有一定难度，且存在刀未晾凉而烫伤叶片的现象，还影响了愈伤组织的诱导率，本专利技术剪取叶片基部时无需在超净台内操作，处理方式更为简单方便，且使用叶片基部进行接种，愈伤组织的诱导率高。
[0012]进一步的，步骤(1)所述李子叶片为7～8月的雨季，距茎尖小于1.0cm、健康、表皮毛少、展开的、叶面积1.0～2.0cm2的嫩叶，将叶片一分为二成叶片基部和叶片尖部，即叶片基部的面积为0.5～1.0cm2。
[0013]本专利技术认为即便是容易污染的7～8月的雨季，靠近茎尖、健康、表皮毛少、展开的嫩叶表面是干净且菌少的，因此，通过对李子叶片采集样品的选择能够进一步保证仅使用75％的酒精进行消毒的效果。
[0014]由于不同品种李子叶片表皮毛量具有差异，因此，这里的“表皮毛少”指的是针对于每一品种而言在样品采集时选择其中表皮毛相对较少的叶片。
[0015]接种后的李子叶片主要在叶脉处长出愈伤组织，据专利技术人观察，叶片基部叶脉比尖部粗状，更容易长出愈伤，因此，剪取李子叶片基部进行接种，可提高材料利用率及接种效率，提高接种质量。此外，接种的叶片剪至0.5～1.0cm2，消毒时不易出现叶片间粘连的现象，进而利于消毒。
[0016]进一步的，步骤(2)所述用质量浓度75％的酒精消毒的具体操作为：在超净台入口处，将李子叶片基部装入超净台内的、经高压灭菌的瓶中，向瓶中倒入质量浓度75％的酒精溶液，密闭消毒50～90s。
[0017]进一步的，步骤(2)所述无菌水漂洗为用无菌水漂洗1次。
[0018]进一步的，步骤(3)所述接种为叶正面朝下接种。
[0019]进一步的，步骤(3)所述培养基为在MS培养基中加入如下质量浓度的组分：6
‑
BA 0.2～0.6mg
·
L
‑1、2,4
‑
D 0.8～2.0mg
·
L
‑1、NAA 0.1～0.6mg
·
L
‑1、蔗糖20～30g
·
L
‑1和琼脂5.5～6.0g
·
L
‑1，pH值5.8～6.2。
[0020]进一步的，步骤(3)中所述暗培养的培养温度为25
±
2℃。
[0021]进一步的，培养期间，统计叶片的污染率、褐化率、褐死率、膨大率、愈伤组织诱导率，观察叶片及其愈伤组织的生长情况。
[0022]进一步的，所述污染率、褐化率、褐死率、膨大率、愈伤组织诱导率的计算公式如下：
[0023][0024][0025][0026][002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种李子叶片组培快繁的接种方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)剪取李子叶片的基部；(2)将李子叶片基部用质量浓度75％的酒精消毒，无菌水漂洗；(3)将漂洗后的叶片接种至培养基中暗培养。2.根据权利要求1所述的一种李子叶片组培快繁的接种方法，其特征在于，步骤(1)所述李子叶片为7～8月的雨季，距茎尖小于1.0cm、健康、表皮毛少、展开的、叶面积1.0～2.0cm2的李子嫩叶，将叶片一分为二成叶片基部和叶片尖部，即叶片基部的面积为0.5～1.0cm2。3.根据权利要求1所述的一种李子叶片组培快繁的接种方法，其特征在于，步骤(2)所述用质量浓度75％的酒精消毒的具体操作为：在超净台入口处，将李子叶片基部装入超净台内的、经高压灭菌的瓶中，向瓶中倒入质量浓度75％的酒精溶液，密闭消毒50～90s。4.根据权利要求1所述的一种李子叶片组培快繁的接种方法，其特征在于，步骤(2)所述无菌水漂洗为用无菌水漂洗1次。5.根据权利要求1所述的一种李子叶片组培快繁的接种方法，其特征在于，步骤(3)所述接种为叶正面朝下接种。6.根据权利要求1所述的一种李子叶片组培快繁的接种方法，其特征在于，步骤(3)所述培养基为在MS培养基中加入如下质量浓度的组分：6
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B...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾玉红，赵志磊，李明，范青，孙权，郑奕宸，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：