一种树莓芽的组培快繁的接种方法技术

本发明专利技术公开了一种树莓芽的组培快繁的接种方法，属于植物组织培养技术领域。本发明专利技术选择树莓木质化、半木质化茎上饱满健康的芽，剥去芽表面的鳞片，切下芽，用质量浓度75％的酒精消毒，无菌水漂洗，接种至培养基中培养。接种第30d芽的污染率为4％～10％、褐死率为0～6％、有效萌发率为90％，芽生长良好。本发明专利技术通过以芽为外植体、消毒前不水洗及剥芽鳞的方法减少了污染；用75％的酒精消毒避免了用剧毒试剂升汞和有刺激性的次氯酸钠消毒；操作简单、省时省力省水省试剂省空间省成本、安全环保，提高了接种质量和效率，适于科研和工厂化的组培育苗领域，为树莓继代增殖、再生体系建立、转基因及基因编辑培育新种质奠定坚实的材料基础。础。础。

【技术实现步骤摘要】
一种树莓芽的组培快繁的接种方法


[0001]本专利技术涉及植物组织培养
，更具体的说是涉及一种树莓芽的组培快繁的接种方法。

技术介绍

[0002]植物组织培养技术被广泛应用于植物快繁、种质保存和遗传改良等领域，其在科学研究与生产应用上的地位非常重要。在组织培养过程中，外植体接种是组培快繁的第一个关键环节。
[0003]带芽茎段是组织培养中常用的外植体，通常是将茎段经洗涤剂和流水冲洗
→
用升汞溶液或次氯酸钠溶液消毒
→
无菌水漂洗
→
用酒精溶液消毒
→
无菌水漂洗
→
剪切成带芽茎段
→
接种到培养基上
→
培养。
[0004]而对于树莓的茎做外植体来说，按照上述传统的接种方法，存在如下问题：(1)树莓茎段上的刺扎手、不易清洗干净、不易被消毒剂消毒而造成污染，给接种人员带来了操作上的不便；(2)接种茎段需要较大的空间；(3)木质化的粗壮的茎段在超净台内接种时用剪子剪和解剖刀切都很费力；(4)茎上的一些微小的机械损伤或病斑也容易在接种后引发污染；(5)茎段上芽的最外层由于长期暴露在空气中而有菌，甚至在芽表面张开的1～3层的芽鳞内藏菌，致使消毒试剂难以彻底消毒而造成污染；(6)本领域技术人员一般通过消毒前的、长时间的流水冲洗以降低后续污染率，然而在流水冲洗的过程中，由于树莓木质化茎中的髓结构，流水会沿着髓结构进入茎的内部，同时会沿着张开的芽鳞片进入芽的内部，使得流水中的真菌、细菌进入外植体的内部而引发污染，这就导致本领域技术人员通常需要采用强度较大的酒精溶液加升汞溶液或酒精溶液加次氯酸钠溶液消毒，以期达到彻底消毒的目的。然而这种方法对消毒时间长短的控制非常严格，消毒时间过短，则消毒不完全，造成后期污染；消毒时间过长，则会对茎段以及芽造成伤害，致使其褐化甚至褐死。另外，升汞对植物、动物、环境而言都是剧毒，次氯酸钠有一定的刺激性气味且容易腐蚀茎段而发生褐化和死亡。此外，流水冲洗把外面的菌带入外植体内部引发污染，会使人们误以为是内生菌导致的污染，甚至使用抗生素来抑菌。综上可知，传统的树莓接种方法操作难度较大、费时、费力、费水、费试剂、费空间、成本高，还会造成对环境的污染以及外植体本身的污染，进而损失材料和时间导致不能高效优质完成接种目标，影响组培快繁的后续环节，影响科研和生产计划，造成经济损失。
[0005]因此，提供一种不用茎段改用芽为外植体、消毒前不用水洗、不用升汞和次氯酸钠消毒的树莓组培快繁的外植体接种方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种树莓芽的组培快繁的接种方法，是一种不用接种茎段、消毒前不进行水洗、消毒前剥芽鳞、不用升汞和次氯酸钠消毒即可有效完成外植体消毒、接种环节，并保证芽在接种后污染率低且正常萌发生长的方法，达到省时省力省水省试
剂省空间省成本、安全环保、优质高效完成树莓的芽做外植体的接种环节，为后续的树莓继代增殖、再生体系的建立、转基因及基因编辑培育新种质奠定坚实的材料基础。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种树莓芽的组培快繁的接种方法，具体步骤如下：
[0009](1)选择树莓木质化、半木质化的茎上饱满、无病虫害、无机械损伤的芽，剥去芽表面的鳞片，切下芽，得预处理芽；
[0010](2)将所述预处理芽用质量浓度为75％的酒精溶液消毒，再用无菌水漂洗，之后接种至培养基中进行光下培养。
[0011]一般来说，接种成功的标准是看芽是否污染、褐化、褐死和萌发。本专利技术技术方案的理论基础是：饱满、健康的芽的内部是没有菌的，芽表面的芽鳞和张开的芽鳞有较多的菌，所以将表面、张开的芽鳞去掉后，做好芽表面的消毒即可不污染。因此，本专利技术技术方案仅用质量浓度为75％的酒精溶液消毒剥去表面芽鳞的芽即可，不必使用强度较大的酒精溶液加升汞溶液或酒精溶液加次氯酸钠溶液消毒方法。其次，本专利技术直接以芽作为外植体，摒弃了现有技术中以茎段为外植体的固有思路，其消毒的难度远低于茎段消毒，且接种效果优异，省时省力省空间省成本。再次，本领域技术人员一般采用流水冲洗以降低后续污染率。通常认为冲洗时间越长，接种后污染率越低。本专利技术认为采用流水冲洗具有髓结构的茎或芽鳞片张开的芽反而增加了将外面的菌带入外植体内部而污染的风险，甚至误导人们以为是内生菌引起的污染，本专利技术突破了固有思路的禁锢，省略了消毒前水洗的步骤，进而达到了比采用“水洗
→
消毒
→
接种”步骤还低的污染率。
[0012]另外，树莓木质化、半木质化的茎段直径可达0.5～1.5cm，在超净台内，在装有无菌滤纸的、经高压灭菌的培养皿内或上方，用剪子剪和解剖刀切茎段时很费力，且茎段容易蹦出接种使用的培养皿，进而增加污染风险和接种难度。本专利技术直接以芽为外植体，操作更为简单、方便。
[0013]进一步，步骤(1)所述剥去芽表面的鳞片为剥去芽表面1～3层的鳞片。
[0014]进一步，步骤(2)的具体操作为：在超净台入口处，将所述预处理芽装入超净台内的、经高压灭菌的瓶中，在瓶中用质量浓度为75％的酒精溶液密闭消毒3～5min，期间进行摇晃，再用无菌水漂洗3～5次。
[0015]进一步，步骤(2)所述培养基为在MS培养基中加入如下质量浓度的组分：6
‑
BA 1.0～1.8mg
·
L
‑1、NAA 0.03～0.08mg
·
L
‑1、GA30.2～1.5mg
·
L
‑1、蔗糖20～30g
·
L
‑1和琼脂5.5～6.0g
·
L
‑1，pH值5.8～6.2。
[0016]进一步，步骤(2)中光下培养条件为温度25
±
2℃，光照1000～2200lx，光照周期12～18h/d。
[0017]进一步，培养期间，统计芽的污染率、褐死率、有效萌发率，观察芽的生长情况。
[0018]进一步，所述污染率、褐死率和有效萌发率的计算公式如下：
[0019][0020][0021][0022]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种树莓芽的组培快繁的接种方法，取得的有益效果为：(1)本专利技术通过以饱满且无病虫害、无机械损伤、健康的芽为外植体及剥芽鳞片的方法减少了外植体本身的污染，避免了接种树莓木质化、半木质化的带刺茎段的污染风险和接种难度，操作简单、省时、省力、省空间；(2)本专利技术通过消毒前不水洗的方法避免水将外面的菌带入有髓结构的带芽茎段内部而导致的污染，进而避免研究人员将水洗引入的污染误认为是内生菌引起的污染；(3)以“饱满、健康的芽的内部没有菌”为理论基础，本专利技术仅用质量浓度75％的酒精溶液消毒剥去表面1～3层芽鳞的芽，就获得了很好的消毒效果；(4)使用质量浓度75％的酒精溶液消毒避免了使用剧毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种树莓芽的组培快繁的接种方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)选择树莓木质化、半木质化的茎上饱满、无病虫害、无机械损伤的芽，剥去芽表面的鳞片，切下芽，得预处理芽；(2)将所述预处理芽用质量浓度为75％的酒精溶液消毒，再用无菌水漂洗，之后接种至培养基中进行光下培养。2.根据权利要求1所述的一种树莓芽的组培快繁的接种方法，其特征在于，步骤(1)所述剥去芽表面的鳞片为剥去芽表面1～3层的鳞片。3.根据权利要求1所述的一种树莓芽的组培快繁的接种方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作为：在超净台入口处，将所述预处理芽装入超净台内的、经高压灭菌的瓶中，在瓶中用质量浓度为75％的酒精溶液密闭消毒3～5min，期间进行摇晃，再用无菌水漂洗3～5次。4.根据权利要求1所述的一种树莓芽的组培快繁的接种方法，其特征在于，步骤(2)所述培养基为在MS培养基中加入如下质量浓度的组分：6
‑
BA 1.0～1.8mg
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L

【专利技术属性】
技术研发人员：顾玉红，赵志磊，李明，李寒，孙权，范青，张雪梅，刘炳响，齐国辉，郭素萍，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：