一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法，该方法是采用氧化石墨烯修饰四氧化三铁与血红素、鸟苷

【技术实现步骤摘要】
一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法


[0001]本专利技术属于化学分析检测
，具体为一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法。

技术介绍

[0002]尿酸（UA, C5H4N4O3）是人体嘌呤的最终代谢产物，已被认为是一种重要的健康生物标志物，其在健康人血清和尿液中的为0.2
‑
0.5mM。当尿酸浓度增加时，由于其溶解度低，将以晶体形式存在，尿酸与痛风、关节炎、肾结石、高尿酸血症等多种疾病密切相关。随着啤酒、肉类、海鲜和其他嘌呤含量高的食物的过量摄入，这些疾病的风险显著增加。因此，快速、准确地测定血清或尿液中尿酸的浓度对这些疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。目前，检测尿酸的方法主要有磷钨酸还原法、高效液相色谱法、尿酸酶还原法等。尿酸酶还原法是基于尿酸氧化酶(UOx)从尿酸中产生H2O2，被辣根过氧化物酶(HRP)等过氧化物酶消耗。HRP是一种天然酶，由于其简单、灵敏和选择性，已广泛应用于生物催化和生物传感领域。然而，天然酶的固有缺陷，如在极端条件下稳定性差、制备和纯化过程复杂、回收率低等，严重阻碍了其实际应用。
[0003]2007年阎锡蕴等首次发现Fe3O
4 纳米颗粒具有过氧化物酶催化活性，此后纳米材料的酶活性研究发展迅速。具有天然酶催化活性的纳米材料被统称为纳米酶。纳米酶具有制备成本低、易于批量生产、稳定性高和活性可调节等优点，在替代天然酶用于生物传感、疾病诊断及治疗、食品安全防控等领域具有巨大潜力。但纳米酶也存在酶活低、选择性差等难题。天然酶与纳米酶的结合可以提高反应的整体效率，克服纳米酶的中等活性和低选择性的问题，另一方面，集成催化剂可以提高生物催化级联的多样性/复杂性和多酶体系的稳定性，但如何实现酶和纳米酶之间的协同效应来构建集成催化剂仍然是一个挑战。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法，该方法利用了天然尿酸氧化酶的特异性及纳米酶的强拟过氧化酶活性，一步完成尿酸的检测。
[0005]本专利技术采用氧化石墨烯修饰四氧化三铁与血红素、鸟苷
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5'
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单磷酸形成复合纳米酶（Fe3O4‑
GO
‑
Hemin/GMP），尿酸氧化酶通过物理吸附固定于四氧化三铁复合纳米酶（UOx@Fe3O4‑
GO
‑
Hemin/GMP），利用尿酸氧化酶的特异性，催化氧化尿酸产生H2O2，利用Fe3O4‑
GO
‑
Hemin/GMP的强拟过氧化酶活性，催化氧化3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(TMB)，产生蓝色化合物（o
‑
TMB），一步完成尿酸检测。本专利技术方法既保证检测的特异性，又达到操作简单、快速的目的，同时复合酶材料稳定、制备方法易控制。本专利技术方法用于血液、尿液及唾液中尿酸检测，回收率在96.3
‑
102.9%之间，与尿酸酶
‑
辣根过氧化酶两步法结果一致。
[0006]本专利技术尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法如下：（1）尿酸工作曲线制作
溶液A：一定浓度范围的尿酸100
µ
L；溶液B：1mg/mL UOx@Fe3O4‑
GO
‑
Hemin/GMP纳米材料100
µ
L；溶液C：10mmol/L的TMB100
µ
L；将A、B及C三种溶液混合，加入50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，其中尿酸在具塞比色管中的浓度范围在10~800
µ
mol/L，以尿酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；（2）实际样品测定血液中尿酸测定：取新鲜血液5mL，放入离心机离心处理，取上清液，加入重量体积浓度10%的氢氧化钠溶液0.1mL和重量体积浓度5%的硫酸锌溶液1mL，混匀，离心分离，取上清液100
µ
L，加入1mg/mL UOx@Fe3O4‑
GO
‑
Hemin/GMP纳米材料100
µ
L，10mmol/L的TMB 100
µ
L，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量；所述离心是在4000
‑
6000r/min 下处理10
‑
15min；尿液中尿酸测定：取新鲜尿样，用活性炭脱色，过滤，用pH5醋酸
‑
醋酸钠缓冲液稀释5倍，取稀释后的尿液 100
µ
L，加入1mg/mL UOx@Fe3O4‑
GO
‑
Hemin/GMP纳米材料100
µ
L，10mmol/L的TMB 100
µ
L，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量；所述活性炭添加量为尿液重量的0.5
‑
1%；唾液中尿酸测定：取唾液2mL，加入质量浓度10%的三氯乙酸2mL，混合均匀，8000r/min下离心10min，上清液用 0.22μm滤膜过滤，取滤液100
µ
L，加入1mg/mL UOx@Fe3O4‑
GO
‑
Hemin/GMP纳米材料100
µ
L，10mmol/L的TMB 100
µ
L，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量。
[0007]所述UOx@Fe3O4‑
GO
‑
Hemin/GMP纳米材料制备如下：（1）四氧化三铁
‑
石墨烯
‑
血红素纳米材料制备将1重量份氧化石墨烯、3
‑
5重量份谷氨酸、6
‑
8重量份FeCl3·
6H2O、300
‑
500重量份乙二醇混合，然后加入0.1mol/L的NaOH调节pH至10，超声处理2
‑
3h，加入0.05
‑
0.1重量份氯化血红素，超声处理10
‑
15min后，置于马弗炉中，200℃下反应10
‑
12h，反应结束冷却至室温，用纯水洗涤数次，冷冻干燥，得四氧化三铁
‑
石墨烯
‑
血红素纳米材料Fe3O4‑
GO
‑
Hemin；所述冷冻干燥是在
‑
20～
‑
40℃下干燥12
‑
24h；（2）四氧化三铁
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法，其特征在于，步骤如下：（1）尿酸工作曲线制作溶液A：一定浓度范围的尿酸100
µ
L；溶液B：1mg/mL UOx@Fe3O4‑
GO
‑
Hemin/GMP纳米材料100
µ
L；溶液C：10mmol/L的TMB100
µ
L；将A、B及C三种溶液混合，加入50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，其中尿酸在具塞比色管中的浓度范围在10~800
µ
mol/L，以尿酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；实际样品测定血液中尿酸测定：取新鲜血液5mL，放入离心机离心处理，取上清液，加入重量体积浓度10%的氢氧化钠溶液0.1mL和重量体积浓度5%的硫酸锌溶液1mL，混匀，离心分离，取上清液100
µ
L，加入1mg/mL UOx@Fe3O4‑
GO
‑
Hemin/GMP纳米材料100
µ
L，10mmol/L的TMB 100
µ
L，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量；尿液中尿酸测定：取新鲜尿样，用活性炭脱色，过滤，用pH5醋酸
‑
醋酸钠缓冲液稀释5倍，取稀释后的尿液 100
µ
L，加入1mg/mL UOx@Fe3O4‑
GO
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Hemin/GMP纳米材料100
µ
L，10mmol/L的TMB 100
µ
L，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量；唾液中尿酸测定：取唾液2mL，加入质量浓度10%的三氯乙酸2mL，混合均匀，8000r/min下离心10min，上清液用 0.22μm滤膜过滤，取滤液100
µ
L，加入1mg/mL UOx@Fe3O4‑
GO
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Hemin/GMP纳米材料100
µ
L，10mmol/L的TMB 100
µ
L，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量。2.根据权利要求1所述的尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨亚玲，王艺节，肖飞健，李秋兰，杨德志，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：