本发明专利技术公开了利用分离获得的PBMC进行诱导培养获得NK细胞，扩大培养后提取NK细胞外泌体，与土霉素与龙仙草提取液混合，通过冷冻真空干燥获得冻干粉，所述的冻干粉可以显著抑制VSV的侵染，减少带状疱疹的病灶，缩短病程，改善预后，达到了传统治方法预料不到的效果。达到了传统治方法预料不到的效果。达到了传统治方法预料不到的效果。
【技术实现步骤摘要】
一种NK细胞冻干粉制备方法及其应用
[0001]本专利技术为免疫治疗领域，具体涉及NK细胞外泌体的冻干粉用于制备治疗病毒感染的医药领域。
技术介绍
[0002]带状疱疹是由水痘带状疱疹病毒(VZV)引起的一种病毒性皮肤病。患处常首先出现潮红斑，很快出现粟粒至黄豆大小的丘疹，簇状分布而不融合，继之迅速变为水疱，疱壁紧张发亮，疱液澄清，外周绕以红晕，各簇水疱群间皮肤正常；皮损沿某一周围神经呈带状排列，多发生在身体的一侧，一般不超过正中线。带状疱疹会有明显的疼痛感，影响正常生活，如果不及时控制，会有细菌感染、后遗神经痛、发角膜炎、角膜溃疡、结膜炎、毒性脑炎和脑膜炎等并发症。
[0003]人类的免疫系统是非常复杂的，它有着大量不同的细胞具有各种各样的功能，这确保侵入的微生物如病毒或细菌能够迅速地使之无害并保持整个机体的健康。自然杀伤细胞（Natural killercell，NK细胞）是天然免疫系统中最重要的细胞，发挥着举足轻重的作用。NK细胞承担着人体第一道天然防线的作用，可清除受感染细胞，防止病毒扩散。NK细胞不同于T、B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。机体抗VZV感染的免疫中，细胞免疫起重要作用，NK细胞可特异性杀死VZV感染细胞；在抗体参予下，介导ADCC效应亦可将VZV感染细胞裂解。NK细胞外泌体由NK细胞释放，具有NK细胞的特性和功能，NK细胞外泌体制备成冻干粉，可以长期储存，保持功能特性不受影响。
[0004]现治疗带状疱疹的药物主要为广谱抗病毒药物阿昔洛韦等。广谱抗病毒药物，治疗效果较差、治疗周期长、对肾功能有影响。急性炎症期可配合使用大剂量糖皮质激素抑制炎症过程，但对慢性疼痛基本无效，且大剂量激素可导致很多并发症。现有的治疗方法存在疗效差、愈后差、易导致后遗症如神经痛的发生等问题。针对现有技术存在的上述问题，本专利技术将开发一种利用NK细胞冻干粉治疗带状疱疹的新产品和方法。
技术实现思路
[0005]本专利技术第一个方面提供一种包含NK细胞外泌体的冻干粉，所述的冻干粉还包括土霉素以及龙仙草提取液。
[0006]本专利技术的第二个方面是提供一种NK细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的NK细胞冻干粉制剂包括NK细胞外泌体、土霉素以及龙仙草提取液。
[0007]在一个具体的实施例中，所述的NK细胞外泌体的提取方式为：1）CD16单抗和RetroNctin预处理培养瓶；2）分离PBMC；3）用含有IFN
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γ、IL
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2、IL
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21、IL
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15和灭活血浆的培养基诱导培养；4）扩增培养后收集培养上清中的外泌体。在另外一个具体的实施例中，所述的预处理包括将CD16单抗与RetroNctin溶于 D
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PBS中，转移至T75培养瓶中，37℃避光放置3小时，或4℃放置过夜；
在另外一个具体的实施例中，所述PBMC的分离步骤为1）：提前30min将淋巴细胞分离液从4℃冰箱中取出置于室温，待温度升至室温后使用；2）将血液倒入50ml离心管内，配平，700g/min 离心 20 min（降速最慢），收集上层液体，56℃灭活30min，然后4℃放置15min，最后2000g离心20min后吸取上层液体备用；3）上述血液离心后的下层加入D
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PBS混匀，定容50ml，各取25ml沿管壁缓慢加至两管淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min（缓升缓降）后，离心管中由上至下分为四层，其中，第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层； 4）收集两管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液。
[0008]在另外一个具体的实施例中， NK细胞的诱导培养步骤为：1）NK细胞培养液的配制：基础无血清培养基100ml加入IFN
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γ、IL
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2、IL
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21和IL
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15及5ml上述灭活的血浆；2）NK细胞培养：将上述得到的细胞用NK细胞培养液重悬，置于恒温培养箱（37℃、5.0% CO2、饱和湿度）中培养；3）视生长情况，适量的补充新鲜的NK细胞培养液进行培养。
[0009]在另外一个具体的实施例中，所述的龙仙草提取液制备方法为：步骤一：取龙仙草研磨至粉末，加入粉末质量2倍的60％的乙醇溶剂浸泡4小时以上，加热回流提取1个小时，过滤，合并提取液，获得初次提取液。 步骤二：初次提取液加水稀释至2倍量体积，调节pH值至8，离心机离心，4000rpm，60min,离心后收集上清，用0 .2um的微孔滤膜过滤，获得龙仙草提取液。
[0010]在另外一个具体的实施例中，所述的NK细胞冻干粉的制备方法为：1）每1000毫升NK细胞外泌体加入50克土霉素和100毫升龙仙草提取液，混匀；2）将步骤5的溶液灌装于无菌的西林瓶内，每瓶4ml；3）：将产品从常温降至
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80
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2℃；4）：至产品完全冻结，抽真空；5）逐渐升华干燥，温度升至35℃左右，水分控制在5%以下；6）检验包装。
[0011]本专利技术的第三个方面提供NK细胞冻干粉在制备治疗病毒感染的药物中的应用；在一个具体的实施中，所述的NK细胞冻干粉为本专利技术第一个方面的所述的NK细胞冻干粉或本专利技术第二个方面所述的方法制备获得的冻干粉；在另外一个具体的实施例中，所述的病毒感染为水痘带状疱疹病毒。
[0012]本专利技术的有益效果是利用分离获得的PBMC进行诱导培养获得NK细胞，扩大培养后提取细胞外泌体，与土霉素与龙仙草提取液混合，通过冷冻真空干燥获得冻干粉，所述的冻干粉可以显著抑制VSV的侵染，减少带状疱疹的病灶，缩短病程，改善预后，达到了传统治方法预料不到的效果。
附图说明
[0013]图1为NK外泌体粒径分布图。
[0014]图2为NK外泌体蛋白含量检测图。
[0015]图3为病毒增值抑制对比效果图。
[0016]图4为豚鼠皮肤感染VZV治疗试验治愈天数与出疹数量对比曲线图。
[0017]图5为家兔皮肤感染VZV治疗试验体温变化对比曲线图。
[0018]图6为家兔皮肤感染VZV治疗试验止痛时间、消肿时间、结痂时间、痊愈时间对比图。
[0019]图7为病例1使用NK细胞外泌体冻干粉前。
[0020]图8为病例1使用NK细胞外泌体冻干粉第三天。
[0021]图9为病例1使用NK细胞外泌体冻干粉七天后。
[0022]图10为病例2使用NK细胞外泌体冻干粉前。
[0023]图11为病例2使用NK细胞外泌体冻干粉第三天。
[0024]图12为病例2使用NK细胞外泌体冻干粉七天后。
具体实施方式
[002本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种包含NK冻干粉，所述的冻干粉为包括NK细胞外泌体溶液、土霉素以及龙仙草提取液经过冷冻干燥制备获得。2.一种权利要求1所述的冻干粉的制备方法，其特征在于，提取NK细胞培养上清中的外泌体，以每1000mL外泌体溶液添加50g土霉素以及100mL龙仙草提取液，经过真空冷冻干燥制备获得。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的NK细胞外泌体的提取方式为：1）CD16单抗和RetroNctin预处理培养瓶；2）分离PBMC；3）用含有IFN
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γ、IL
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2、IL
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15和灭活血浆的培养基诱导培养；4）扩增培养后收集培养上清中的外泌体。4.根据权利要求3所述的方法，所述PBMC的分离步骤为1）：提前30min将淋巴细胞分离液从4℃冰箱中取出置于室温，待温度升至室温后使用；2）将血液倒入50ml离心管内，配平，700g/min 离心 20 min，收集上层液体，56℃灭活30min，然后4℃放置15min，最后2000g离心20min后吸取上层液体备用；3）上述血液离心后的下层加入D
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PBS混匀，定容50ml，各取25ml沿管壁缓慢加至两管淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min后，离心管中由上至下分为四层，其中，第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层； 4）收集两管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液。5.根据权利要求3所述的方法，其中NK细胞的诱导培养步骤为：1）NK细胞培养液的配制：基础无血清培养基100ml加入IFN
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γ、IL
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2、IL
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21和IL
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【专利技术属性】
技术研发人员：朱哲，张涛，
申请(专利权)人：北京荟科柘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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