使用牙髓干细胞外泌体治疗脑缺血再灌注损伤的方法技术

本发明专利技术涉及牙髓干细治疗技术领域，尤其为一种使用牙髓干细胞外泌体治疗脑缺血再灌注损伤的方法，牙髓干细胞来源的外泌体获取，从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和和牙周病变的第三磨牙

【技术实现步骤摘要】
使用牙髓干细胞外泌体治疗脑缺血再灌注损伤的方法


[0001]本专利技术涉及牙髓干细胞治疗
，具体为使用牙髓干细胞外泌体治疗脑缺血再灌注损伤的方法。

技术介绍

[0002]目前多种间充质干细胞来源的外泌体能够减轻脑缺血再灌注损伤，比如脂肪干细胞来源外泌体及骨髓干细胞来源外泌体。然而间充质干细胞的另一重要类型(牙髓干细胞)来源的外泌体能否减轻脑缺血再灌注损伤不得而知。牙髓干细胞的获取是来自脱落的智齿，所以与其他类型的间充质干细胞相比，牙髓干细胞的获取损伤更小，更容易获得，所以用牙髓干细胞外泌体以减轻脑缺血再灌注损伤有更好的临床应用前景。
[0003]目前已有文献证实骨髓间充质干细胞及脂肪间充质干细胞来源的外泌体可以发挥抗脑缺血再灌注损伤的作用，但这两种间充质干细胞的获取是一个对机体有损伤的过程，限制了其临床应用，因此需要使用牙髓干细胞外泌体治疗脑缺血再灌注损伤的方法对上述问题做出改善。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供使用牙髓干细胞外泌体治疗脑缺血再灌注损伤的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]使用牙髓干细胞外泌体治疗脑缺血再灌注损伤的方法，具体的步骤为
[0007]S1：牙髓干细胞来源的外泌体获取，从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和和牙周病变的第三磨牙
‑
75％酒精消毒牙齿表面
‑
牙科钻头取出牙髓
‑
切成1mm3小块
‑
用含有2.5％抗生素的PBS冲洗3次
‑
将牙髓组织放入1.5mlEP管中用3mg/ml的I型胶原酶消化
‑
4mg/mL的分散酶37℃放置30分钟
‑
细胞重悬
‑
37℃5％CO2温箱中培养(培养基：DMEM+10％的胎牛血清+100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素)
‑
5天之后换液，之后每三天更换一次；待细胞融合至80％左右后，消化离心，传至第三代；第三代细胞融合至80％左右，去除上层培养液，PBS清洗三次，换为无血清培养基，继续培养48小时后收集上层培养液；
[0008]S2：将该培养液4℃，3000g，离心15min，去除细胞及细胞碎片，上清液转移到无菌容器中，添加适当体积的ExoQuick
‑
TC(System Biosciences,LLC)(每10ml样本加入2ml试剂)倒转试管充分混，4℃过夜；后1500g离心30min，外泌体在试管底部呈米色或白色沉；去除上清4℃，1500g，5min，去除残留的试剂，抽吸去除上层液体；100μlPBS吹打沉淀重悬，即外泌体溶液；
‑
80℃长期保存；
[0009]S3：小鼠脑缺血再灌注损伤模型制作，小鼠用2％异氟醚N2/O2(70％:30％)混合物麻醉，并通过面罩用1％异氟醚维持；固定小鼠于手术台后，用镊子提起小鼠颈部皮肤，自胸骨柄到下颌骨间行1cm长的正中纵切口，暴露两个下颌下腺，将它们钝性分开，将右侧的腺体拉向旁侧，以暴露胸锁乳突肌，把小鼠移至解剖显微镜下，调节放大倍数至20倍，用拉钩
拉开胸锁乳突肌肌腹，并固定，暴露肩胛舌骨肌，将肩胛舌骨肌钝性撕断，分离二腹肌下腹并用自制拉钩拉开固定，暴露颈动脉鞘，小心撕开颈动脉鞘，暴露颈总动脉并轻轻分离，小心不要损伤与之伴行的迷走神经，用6
‑
0丝线结扎颈总动脉近心断，分离颈外动脉，结扎颈外动脉近心断，分离颈内动脉，用动脉瘤阻断夹临时阻断颈内动脉，在颈总动脉远端的动脉壁上用显微剪刀剪一个小口，用硅胶涂层6
‑
0尼龙长丝线栓(广州佳灵生物技术有限公司)通过小口插向颈总动脉分叉处，松开临时阻断夹，推送线栓使其进入颈内动脉，遇到轻微阻力后丝线结扎固定丝线，此时线栓头端距颈动脉分叉约9
‑
10mm，将下颌下腺归位，缝合皮肤，2h后实行再灌注，将线栓拔出后结扎颈总动脉远端并缝合皮肤；2h后模型组尾静脉注射100μlPBS，外泌体干预组尾静脉注射含10μg外泌体的PBS溶液100μl；
[0010]S4：小鼠脑组织切片染色，造模后第7天处死小鼠，取出大脑，将大脑在
‑
80℃下冷冻10分钟，并在冠状面上切成2毫米厚的切片；使用2,3,5
‑
氯化三苯基四唑(TTC)染色(TTC，Sigma
‑
Aldrich，德国)评估脑梗死体积大小；脑切片在2％TTC溶液中于37℃孵育15分钟，并用4％多聚甲醛固定；然后用数码相机拍摄染色切片；用Adobe Photoshop 2020软件(美国国立卫生研究院)测量梗死体积；脑梗死面积计算方法如下：
[0011]脑梗死面积(％)＝(白色脑组织总面积)/(脑组织总面积)
×
100％。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0013]1、本专利技术中，通过脑血栓形成导致的急性脑梗死是临床上最常见的临床类型，本专利技术采用的大脑中动脉栓塞模型是目前公认的最成熟有效的模型，为该专利技术的实施提供了保障。
[0014]2.本专利技术中，牙髓干细胞获取是来自废弃的脱落智齿，对供体零损伤，免于伦理问题。实现牙髓干细胞的临床应用较其他间充质干细胞更加理想。本专利技术体外成功培养出牙髓干细胞，并分离其外泌体，为开展针对牙髓干细胞的研究提供了实验基础。
[0015]3.本专利技术中，脑组织是机体对缺血缺氧最敏感的器官，血流供应中断数分钟即发生不可逆的脑损伤。而在脑损伤周围存在着大量缺血状态但仍未发生梗死的脑组织，即缺血半暗带。如何挽救半暗带，避免更多的脑组织发生不可逆的梗死是临床治疗的关键。本专利技术通过动物实验发现，牙髓干细胞来源的外泌体可减轻小鼠脑缺血再灌注损伤后脑梗死面积，为实现牙髓干细胞外泌体治疗脑缺血再灌注损伤的临床应用提供了关键技术。
附图说明
[0016]图1为本专利技术的整体流程结构示意图；
[0017]图2为本专利技术的流式细胞术鉴定牙髓干细胞对照图；
[0018]图3为本专利技术的透射电镜鉴定外泌体图；
[0019]图4为本专利技术的第一组脑梗死体积对照图；
[0020]图5为本专利技术的第二组脑梗死体积对照图；
[0021]图6为本专利技术的第三组脑梗死体积对照图；
[0022]图7为本专利技术的三组脑梗死比较图。
具体实施方式
[0023]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，
显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例,基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]为了便于理解本专利技术，下面将参照相关对本专利技术进行更全面的描述。给出了本专利技术的若干实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.使用牙髓干细胞外泌体治疗脑缺血再灌注损伤的方法，其特征在于：具体的步骤为S1：牙髓干细胞来源的外泌体获取，从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和和牙周病变的第三磨牙
‑
75％酒精消毒牙齿表面
‑
牙科钻头取出牙髓
‑
切成1mm3小块
‑
用含有2.5％抗生素的PBS冲洗3次
‑
将牙髓组织放入1.5mlEP管中用3mg/ml的I型胶原酶消化
‑
4mg/mL的分散酶37℃放置30分钟
‑
细胞重悬
‑
37℃5％CO2温箱中培养(培养基：DMEM+10％的胎牛血清+100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素)
‑
5天之后换液，之后每三天更换一次；待细胞融合至80％左右后，消化离心，传至第三代；第三代细胞融合至80％左右，去除上层培养液，PBS清洗三次，换为无血清培养基，继续培养48小时后收集上层培养液；S2：将该培养液4℃，3000g，离心15min，去除细胞及细胞碎片，上清液转移到无菌容器中，添加适当体积的ExoQuick
‑
TC(System Biosciences,LLC)(每10ml样本加入2ml试剂)倒转试管充分混，4℃过夜；后1500g离心30min，外泌体在试管底部呈米色或白色沉；去除上清4℃，1500g，5min，去除残留的试剂，抽吸去除上层液体；100μlPBS吹打沉淀重悬，即外泌体溶液；
‑
80℃长期保存；S3：小鼠脑缺血再灌注损伤模型制作，小鼠用2％异氟醚N2/O2(70％:30％)混合物麻醉，并通过面罩用1％异氟醚维持；固定小鼠于手术台后，用镊子提起小鼠颈部皮肤，自胸骨...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶青松，高亮，李松，王伦云，
申请(专利权)人：优牙生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：