一株产苯酞类成分的贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种产苯酞类成分的贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株及其应用，本菌株是从当归根际土壤中分离纯化并培养获得的，经微生物16S rDNA测序鉴定为芽孢杆菌属。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2021766。本发明专利技术为规模化发酵制备苯酞类成分提供一株性状稳定、培养基简单、生长良好的贝莱斯芽孢杆菌菌株，并建立实用简便的发酵培养方法及其分离提取工艺，其发酵液经提取浓缩后的成分可作为当归活性成分的新来源。贝莱斯芽孢杆菌XG2可促进当归种子萌发、提高当归苗株高、鲜重的作用。鲜重的作用。鲜重的作用。

【技术实现步骤摘要】
一株产苯酞类成分的贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及一种贝莱斯芽孢杆菌菌株，该菌株可产苯酞类成分，并可促进当归种子萌发和植株生长，属于微生物


技术介绍

[0002]土壤中细菌群落的结构和组成可以有效地反应土壤生态系统的健康状况、土壤生产力的大小及环境干扰程度的高低，根际微生物的种群数量和结构上的改变可以引起微生物菌群功能上的改变。植物促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPRs)，是根系周围土壤中分布于植物根系表面的一群自生细菌，通过分泌相关植物激素或者激素前体物质影响植物根系结构。PGPR通过固氮、溶磷、解钾、溶铁等作用，促进吲哚乙酸、脱落酸、细胞分裂素、赤霉素、乙烯等植物激素分泌，起到促进植物生长，提高植物抗逆能力的作用。当添加外源性微生物菌剂时可改变土壤微生物生态水平，进而改善根际土养分的含量和植物对养分的吸收利用能力，提高当归的品质和产量。
[0003]同时，根际菌具有强大的代谢功能，除了产生营养成分、植物激素等，还能产生与宿主植物相同或类似的活性成分。根际菌种类的多样性也赋予了其代谢产物的多样性，利用根际菌发酵的方法用于挖掘新资源具有巨大的潜力，利用能够代谢产生相应活性成分的根际菌来生产新型、高效、低成本的活性药物，可有效缓解珍稀中药植物资源紧缺的现状。
[0004]当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，分布甘肃、四川、云南等地，具有补血活血，调经止痛，润肠通便的作用。当归主要的活性物质有挥发油、有机酸、多糖类、黄酮类、氨基酸、微量元素等。其中挥发油中主要包含藁本内酯、正丁基苯酞、丁烯基苯酞、洋川芎内酯等成分。临床研究表明苯酞类成分在平滑肌系统、心血管系统、免疫系统、神经系统等方面具有良好的药理活性。但当归生长周期长、生长速度慢、产地依赖性强、道地野生资源破坏严重、栽培过程又易出现早薹、病虫害等，严重制约了当归产业的快速良性发展。目前，已有一些学者对当归的微生物资源进行研究，但是菌株数量及种类有限，功能筛选研究较为薄弱，进一步筛选出新的产当归活性成分和促进当归优质生长的菌株，对深入开展微生物发酵产苯酞类成分，寻找新型苯酞类成分来源，缓解当归资源短缺现状，研制生物菌肥，开展绿色健康种植等具有重要意义。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种产苯酞类成分的贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株及其该菌的分离方法、发酵培养方法。本专利技术另外一个目的是提供该菌发酵产物分析及其在当归种子萌发和植物生长过程中的应用。
[0006]技术方案：为实现以上目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0007]本专利技术提供的产苯酞类成分的贝莱斯芽孢杆菌XG2，该菌株是从当归根际土壤中分离纯化并培养获得的，经微生物16S rDNA测序鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus spp.)。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2021766；该菌株的16S rDNA
序列如Sequence listing所示。
[0008]本专利技术提供的贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株分离方法，包括振荡、接种、分离、培养及保存，具体步骤为：
[0009]a)振荡：将当归根部周围土壤剥离，抖落收集根际表面土壤，5g土壤置于100mL无菌水的三角瓶中，30℃恒温摇床160r/min振荡2h，静置30min，取得土壤原液(10
‑1)，再用移液枪吸取1mL上清液加到9mL无菌水中，充分摇匀，即得(10
‑2)，依次类推，制得10
‑1‑
10
‑6稀释液。
[0010]b)分离：吸取0.1mL10
‑4、10
‑5、10
‑6的土壤稀释液，接入已配制好的LB固体培养基中，每一稀释度设3个重复。将平板倒置，30℃培养并随时观察菌落生长情况，用接种环接种形态不同的细菌于LB固体培养基上，反复纯化，直至得到单一菌落。
[0011]c)培养及保存：将平板上纯化完成的细菌挑取至装有LB液体培养基的三角瓶中，30℃恒温摇床160r/min振荡24h，与50％甘油1：1装入已灭菌冻存管在，混合均匀，封口膜封口，于
‑
80℃超低温冰箱中保存。
[0012]本专利技术提供的贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株发酵培养方法，包括以下步骤：将Bacillus velezensis XG2菌种接种于50mLLB液体培养基中，于30℃恒温摇床160r/min活化培养，24h后取1mL活化菌种至装有500mL LB液体培养基的三角瓶中进行发酵，30℃、160r/min摇床培养24h；经以上发酵培养后，收集发酵液。
[0013]作为优选方案，以上所述的贝莱斯芽孢杆菌的发酵方法，所述的LB培养基由10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl组成。
[0014]贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株发酵产物分析，以所述发酵方法获得的发酵液为原料，用乙酸乙酯萃取三次，挥干乙酸乙酯，用甲醇复溶，溶液可用于检测其发酵产物，共检测发现其含有三种苯酞类成分：藁本内酯、正丁基苯酞、丁烯基苯酞。
[0015]贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株在当归种子萌发和植物生长过程中的应用，以所述发酵方法获得发酵液，稀释为不同OD浓度的菌液，与当归种子、当归无菌苗进行共培养。
[0016]有益效果：与现有研究相比，本专利技术具有以下优点：
[0017](1)本专利技术提供的贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株可直接代谢产生藁本内酯、正丁基苯酞、丁烯基苯酞等苯酞类成分，为深入开展微生物发酵产苯酞成分的研究具有重要意义，为当归活性成分提供新的来源。
[0018](2)本专利技术提供的贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株可促进当归种子萌发，提高当归苗株高、鲜重，可用于研制成本低、无污染、增产稳定、可有效改善土壤的生物菌肥，进而应用于当归绿色健康种植产业。
附图说明
[0019]图1贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株的菌落正面；
[0020]图2贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株的菌落背面；
[0021]图3六种苯酞类成分标准品总离子图；图中各成分保留时间藁本内酯:12.67min；丁烯基苯酞:12.81min；正丁基苯酞:11.55min；洋川芎内酯A:11.15min；洋川芎内酯H:4.99min；洋川芎内酯I:4.76min)；
[0022]图4贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株样品苯酞类成分总离子图；
[0023]图5藁本内酯标准品色谱图；
[0024]图6贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株样品藁本内酯总离子图(TIC)和提取离子图(EIC)；
[0025]图7正丁基苯酞标准品总离子图(TIC)和提取离子图(EIC)；
[0026]图8贝莱斯芽孢杆菌XG2菌株样品正丁基苯酞总离子图(TIC)和提取离子图(EIC)；
[0027]图9丁烯基苯酞标准品总离子图(TIC)和提取离子图(EIC)；
[0028本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株产苯酞类成分的贝莱斯芽孢杆菌，其保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M 2021766，分类命名为Bacillus velezensis XG2。2.一种利用贝莱斯芽孢杆菌进行发酵的方法，其特征在于，将权利要求1所述的Bacillus velezensis XG2菌种接种于LB液体培养基中，恒温摇床活化培养，然后取活化菌种至装有LB液体培养基的三角瓶中进行发酵，摇床培养；收集发酵液。3.根据权利要求2所述的利用贝莱斯芽孢杆菌进行发酵的方法，其特征在于，将权利要求1所述的Bacillus velezensis XG2菌种接种于LB液体培养基中，于30℃恒温摇床160r/min活化培养，24h...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘培，冯伟萌，张森，严辉，段金廒，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：