一株枯草芽孢杆菌HKS018及其在生产β-甘露聚糖酶中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一株枯草芽孢杆菌HKS018及其在生产β

【技术实现步骤摘要】
一株枯草芽孢杆菌HKS018及其在生产
β
‑
甘露聚糖酶中的应用


[0001]本专利技术涉及微生物，特别是一株枯草芽孢杆菌HKS018及其在生产β
‑
甘露聚糖酶中的应用。

技术介绍

[0002]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生长、繁殖速度较快，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。有的菌株是α
‑
淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'
‑
核苷酸酶的菌种。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。
[0003]β
‑
甘露聚糖酶(β
‑
mannanase，EC.3.2.l.78)能够攻击甘露聚糖骨架的内部β
‑
1，4糖苷键，释放甘露寡糖。β
‑
甘露聚糖酶广泛存在于细菌、真菌、放线菌、植物和动物中。水解产物甘露寡糖(mannan
‑
oligosaccharide，MOS)不仅能够刺激肠道正常菌群的增殖，抑制病原微生物的生长，对乳杆菌(Lactobacilli)和双歧杆菌(Bifidobacteria)生长有益，还具有多种生物学活性，如增强动物免疫、调节糖脂代谢、促生长和抗氧化等作用，MOS还通过调控肠道微生物增强了二甲双胍的降糖效果。
[0004]β
‑
甘露聚糖酶在自然界中普遍存在，微生物是其最主要的生产来源。目前，应用于工业生产β
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甘露聚糖酶的菌种多为曲霉、芽抱杆菌、酵母等，在食品、医药、饲料等领域有广泛的应用。β
‑
甘露聚糖酶在饲料工业中作为一种饲料添加剂，能有效地降解饲料中的甘露聚糖，提高动物对饲料的消化能力。目前依据文献报道的细菌来源的β
‑
甘露聚糖酶比真菌来源的温度稳定性更好，尤其是芽孢杆菌来源的甘露聚糖酶。虽然目前有大量不同种类不同来源的β
‑
甘露聚糖酶被发现，但野生型β
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甘露聚糖酶尚不能完全满足工业化生产的需求，酶学性质上都存在一定的缺陷，如野生型β
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甘露聚糖酶活性较低，耐高温能力差，无法承受饲料添加剂制粒阶段的高温。通过异源表达提高β
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甘露聚糖酶的酶活和适用范围，获取活性较高的、耐高温、生产成本较低的β
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甘露聚糖酶，无疑是β
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甘露聚糖酶进一步扩大应用市场的重要方式。目前已经实现了β
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甘露聚糖酶基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、黑曲霉和里氏木霉中的成功表达。为了满足β
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甘露聚糖酶在食品加工、功能性食品开发、养殖业、医药、造纸等领域的应用，开发耐高温、高稳定性的β
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甘露聚糖酶具有重要意义。但如何应用新筛选的枯草芽孢杆菌来生产β
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甘露聚糖酶，以满足工业生产中对β
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甘露聚糖酶的需要，至今未见有公开报导。

技术实现思路

[0005]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一株枯草芽孢杆菌 HKS018及其在生产β
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甘露聚糖酶中的应用，可有效解决β
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甘露聚糖酶的制备，满足工业
生产中对β
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甘露聚糖酶的需要问题。
[0006]本专利技术解决的技术方案是，一株枯草芽孢杆菌HKS018，分类命名为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)，于2021年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No：22574，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
[0007]所述的枯草芽孢杆菌HKS018可有效用于生产β
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甘露聚糖酶，实现枯草芽孢杆菌HKS018 在生产β
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甘露聚糖酶中的应用，所生产的β
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甘露聚糖酶最适pH8.5，最适反应温度70℃，Mg
2+
和Cu
2+
具有明显的促进β
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甘露聚糖酶活性的作用。
[0008]本专利技术枯草芽孢杆菌HKS018是新筛选的一株枯草芽孢杆菌，可有效用于生产β
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甘露聚糖酶，该β
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甘露聚糖酶最适pH8.5，最适反应温度70℃；在pH5.0～9.0和60～80℃，酶的稳定性良好，在食品、养殖、医药、造纸、纺织等行业方面具广泛应用价值，实现了枯草芽孢杆菌HKS018来源的β
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甘露聚糖酶基因的异源表达，为其在生物催化制备低聚甘露糖的工业应用奠定了基础和提供了技术保障，有巨大的经济和社会效益。
附图说明
[0009]图1为本专利技术枯草芽孢杆菌HKS018菌株的水解透明圈筛选图。
[0010]图2为本专利技术枯草芽孢杆菌HKS018重组质粒构建图谱图。
[0011]图3为本专利技术枯草芽孢杆菌HKS018质粒提取产物电泳图。
[0012]图4为本专利技术枯草芽孢杆菌HKS018 SDS
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PAGE凝胶电泳图。
[0013]图5为本专利技术温度对β
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甘露聚糖酶活性的影响图。
[0014]图6为本专利技术不同温度下β
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甘露聚糖酶的稳定性曲线图。
[0015]图7为本专利技术pH对β
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甘露聚糖酶活性的影响曲线图。
[0016]图8为本专利技术金属离子和EDTA对β
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甘露聚糖酶活性的影响图。
具体实施方式
[0017]以下结合具体情况对本专利技术的具体实施方式作详细说明。
[0018]在具体实施中，一株枯草芽孢杆菌HKS018，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2021年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No：22574，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
[0019]该枯草芽孢杆菌HKS018在制备β
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甘露聚糖酶中的应用，其应用方法包括以下步骤：
[0020](1)克隆枯草芽孢杆菌HKS018：
[0021]以枯草芽孢杆菌HKS018菌株的基因组DNA为模板，对其β
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甘露聚糖酶基因克隆，PCR 反应体系为：1μL基因组DNA模板，1μL上游引物(10μmol/L)，1μL下游引物(10μmol/L)，25μL Taq PCR MasterMix(2
×...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株枯草芽孢杆菌HKS018，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），于2021年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No：22574，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HKS018在生产β
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甘露聚糖酶中的应用。3.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌HKS018在生产β
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甘露聚糖酶中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）克隆枯草芽孢杆菌HKS018：以枯草芽孢杆菌HKS018菌株的基因组DNA为模板，对其β
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甘露聚糖酶基因克隆，PCR反应体系为：1
µ
L基因组DNA模板，1
µ
L上游引物，浓度10
µ
mol/L，1
µ
L下游引物，浓度10
µ
mol/L，25
µ
LTaq PCR MasterMix(2
×
)，22
µ
L ddH2O，PCR扩增反应条件为：95℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min；扩增完成后，使用0.8%的琼脂糖凝胶检测合格，得质粒pET
‑
20b(+)；所述的上游引物
‑
F：5
´‑
AAGCTTATGGGGGAGTTGCATT
‑3´
，下游引物
‑
R：5
´‑
CTCGAGTTCAACGATTGGCGTT
‑3´
；（2）将质粒pET
‑
20b(+)经HindⅢ和XhoⅠ酶切后，胶回收线状质粒条带，检测合格后，使用T4连接酶与目的基因片段16℃过夜连接，转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞，涂布在含有50
µ
g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃，倒置过夜培养；挑取阳性转化子经菌落PCR扩增检测正确后，得扩增的重组质粒pET
‑
20b(+)
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：雷高，杨文玲，权淑静，王佰涛，刘德海，刁文涛，李珊珊，李亮亮，胡虹，巩涛，李磊，甄静，马焕，王继雯，冯菲，解复红，张志龙，陈国参，
申请(专利权)人：河南省科学院，
类型：发明
国别省市：