一种多层三维数字核酸扩增芯片制造技术

本实用新型专利技术涉及数字PCR领域，具体涉及一种多层三维数字核酸扩增芯片。本实用新型专利技术的多层三维数字核酸扩增芯片中，可实现对微阵列芯片的多层叠加，大幅增加数字核酸扩增的反应单元数目，使得核酸定量的动态范围和检测下限精度均有大幅提高，有利于在实际检测中大幅增加反应通量。此外，本实用新型专利技术还提供了多层三维数字核酸扩增的制作方法与使用方法，可以使定量结果的准确性进一步得到改善。量结果的准确性进一步得到改善。量结果的准确性进一步得到改善。

【技术实现步骤摘要】
一种多层三维数字核酸扩增芯片


[0001]本技术涉及数字PCR领域，具体涉及一种多层三维数字核酸扩增芯片。

技术介绍

[0002]自从1983年PCR的技术以来，核酸定量已经从定性技术 (PCR后电泳)发展到半定量(荧光定量PCR,qPCR)，随着数字PCR (digital PCR,dPCR)的出现，已经发展到绝对定量。数字PCR技术通过将核酸模板随机分配到大量的反应单元中进行扩增反应，扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，由于核酸分子的随机分配符合泊松分布，因此最后通过泊松分布公式计算即可得到样品的原始浓度或含量。分区数目越大，核酸定量范围越大，精度越高；总反应体积越大，检测限越低。
[0003]数字PCR对核酸分子的定量检测分为三步：分配代测样品 (partition)、核酸扩增、荧光检测。根据分配策略的不同，目前的dPCR 技术分为两大类，分别是基于物理分隔的芯片数字PCR(chip
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baseddigital PCR,cdPCR)和基于液滴乳化的液滴数字PCR(droplet
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baseddigital PCR,ddPCR)。到目前为止，ddPCR由于其优点已成为生物和医学领域最常用的方法。首先，液滴产生芯片的设计和制造相对容易。第二，液滴的大小和数量是灵活的，因此很容易产生数以百万计的液滴。最后，液滴扩增产物可以很容易地回收，这在二代测序文库定量的应用中很重要。但是，它有一些局限性，在PCR过程中，由于热运动或油的蒸发，一些液滴会合并，这会导致液滴体积的差异，使核酸分子分配概率产生差异，不符合泊松分布，对精度产生显著影响。此外，液滴dPCR还需要许多设施，包括液滴发生器、液滴传输系统和液滴计数系统，这增加了设备的初始成本，并需要持续消耗昂贵的材料。这些缺点阻碍了其在临床上的广泛应用。与ddPCR相比，cdPCR 通过制造物理微孔分割样品，成本更低，容易检测，特别是在护理点检测中，基于芯片的数字PCR的结果可以很容易地使用荧光显微镜进行检测。但是由于其微孔数目较少，通量低，应用不是很广泛。
[0004]目前，国内商品化的数字PCR平台大多为ddPCR，虽然各大科研单位与机构对于成本更低的芯片数字PCR也有研究，但这些研究多聚焦于进样方式、防止反应液蒸发等基础问题，在反应单元的体积、数量、排列方面并未打破陈规，因此在灵敏度和通量等关键科学问题上难有较大的进展与突破。国外的一些研究虽然报道了能产生百万级反应分区的数字PCR芯片，但采用的是提高芯片微孔面密度的策略，这种做法虽然提高了反应单元的数量，但是使得反应单元体积急剧下降，提高了精度却不能兼顾灵敏度，应用范围较窄，无法满足癌症早期筛查，新冠病毒诊断等分子诊断需求。而且面密度的提高导致芯片制作要求和成品损失率的升高，成本更高。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本技术提供了一种多层三维数字核酸扩增芯片。
[0006]具体而言，本技术首先提供一种多层三维数字核酸扩增芯片，其包括：
[0007]层叠设置的多个微阵列芯片和一个储水层芯片；
[0008]在每个所述微阵列芯片上设有进液口、第一分支型分配通道、若干微孔阵列、通油孔、蓄水圈和蓄水圈进出液口；其中，所述进液口和微孔阵列通过所述第一分支型分配通道连通设置；所述通油孔与所述微孔阵列通过第一分支型分配通道连接设置；所述蓄水圈进出液口通过所述蓄水圈连通设置；所述蓄水圈设置在所述微孔阵列与微阵列芯片的边沿之间，且与所述微孔阵列不连通；所述第一分支型分配通道、微孔阵列和蓄水圈的高度小于所述微阵列芯片的厚度；而在不同层的微阵列芯片之间，所述进液口相互连通设置，所述通油孔相互连通设置，所述蓄水圈进出液口相互连通设置；
[0009]在所述储水层芯片上设有进出水口、储水通道和第二分支型分配通道；所述进出水口和所述储水通道通过所述第二分支型分配通道连通设置；
[0010]所述储水层芯片上的储水通道与最上层微阵列芯片上的微孔阵列接触设置，且所述储水通道覆盖所述微孔阵列。
[0011]本技术发现，将多个微阵列芯片层叠组合后，可以有效地提高提高反应单元的数量，不过，相较于单层微阵列芯片，多层微阵列芯片结构在使用时对反应单元的密封性、均一性及热处理中的结构稳定性等均具有更高的要求。而上述结构有利于满足恒温扩增反应对多层三维数字核酸扩增芯片的性能要求，实现对反应单元数量的有效提高。
[0012]作为优选，当所述微孔阵列中的微孔沿所述第一分支型分配通道的每条分支通道排列，沿分支通道轴线方向相邻的微孔依次交错分布于分支通道的两侧，且每个微孔均与通道连通设置时，可以进一步防止交叉污染，从而更有利于提升长时间扩增反应中单个反应单元的密封性。
[0013]作为优选，所述微阵列芯片和所述储水层芯片的材料为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)。
[0014]作为优选，所述微孔阵列的高度为20
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200微米，所述第一分支型分配通道的高度与所述微孔阵列的高度的比例为1：3
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10。通过按上述比例设置微孔和通道的高度差，进一步有利于改善反应单元的密封效果，同时，也有利于缓解充入液体(尤其是油类物质)时对芯片所造成的形变压力，进而有利于保证正压与负压交替通油的可行性，使定量结果更准确。
[0015]更优选的，所述微孔阵列中单个微孔的孔径大于所述第一分支型分配通道中单条通道的宽度。
[0016]作为优选，所述蓄水圈的高度与所述微孔阵列的高度的比例为1： 0.5
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2。
[0017]作为优选，所述储水通道和第二分支型分配通道的高度均为 50
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100微米，所述储水通道的宽度为200
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500微米，相邻两个储水通道的间隔小于储水通道的高度。这种设置更有利于减少微阵列芯片可能的水分蒸发。
[0018]作为优选，所述微孔阵列中微孔的俯视形状为方形，圆形或者其他多边形，当为方形时更有利于成像效果。
[0019]作为优选，所述多层三维数字核酸扩增芯片还包括：
[0020]一个玻片，其固定设置在最底层的微阵列芯片的下方，且覆盖所述微阵列芯片的底面。
[0021]本技术提供的多层三维数字核酸扩增芯片通过叠加微阵列芯片层，大幅增加数字核酸扩增的反应单元数目，使得核酸定量的动态范围和精度均有提高；除此之外，还可
以横向或纵向伸缩微孔阵列，或同时增加与微孔阵列匹配的进液口、通油孔和分支型分配通道形成独立的反应液加入通路，实现单张芯片多个样品的同时反应，能够实现高通量地进行核酸定量。
[0022]本技术中所提到的“最上层”、“最底层”是相对而言的，其朝向的判断标准是以微阵列芯片有微孔阵列的一面的朝向为上。在实际方案中，可根据其他朝向判断标准(比如微阵列芯片无微孔阵列的一面的朝向为上)，对“最上层”、“最底层”的说法进行调整，其均属于本实用新本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多层三维数字核酸扩增芯片，其特征在于，其包括：层叠设置的多个微阵列芯片和一个储水层芯片；在每个所述微阵列芯片上设有进液口、第一分支型分配通道、若干微孔阵列、通油孔、蓄水圈和蓄水圈进出液口；其中，所述进液口和微孔阵列通过所述第一分支型分配通道连通设置；所述通油孔与微孔阵列通过所述第一分支型分配通道连接设置；所述蓄水圈进出液口通过所述蓄水圈连通设置；所述蓄水圈设置在所述微孔阵列与微阵列芯片的边沿之间，且与所述微孔阵列不连通；所述第一分支型分配通道、微孔阵列和蓄水圈的高度小于所述微阵列芯片的厚度；而在不同层的微阵列芯片之间，所述进液口相互连通设置，所述通油孔相互连通设置，所述蓄水圈进出液口相互连通设置；在所述储水层芯片上设有进出水口、储水通道和第二分支型分配通道；所述进出水口和所述储水通道通过所述第二分支型分配通道连通设置；所述储水层芯片上的储水通道与最上层微阵列芯片上的微孔阵列接触设置，且所述储水通道覆盖所述微孔阵列。2.根据权利要求1所述的多层三维数字核酸扩增芯片，其特征在于，所述微孔阵列中的微孔沿所述第一分支型分配通道的每条分支通道排列，沿分支通道轴线方向相邻的微孔依次交错分布于分支通道的两侧，且每个微孔均与通道连通设置。3.根据权利要求1所述的多层三维数字核酸扩增芯片，其特征在于，所述微阵列芯片和所述储水层芯片的材料为聚二甲基...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗春雄，荣楠，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：新型
国别省市：