一种柑橘愈伤组织和悬浮细胞的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种柑橘愈伤组织和悬浮细胞的培养方法，包括：S1：选取种子消毒后取出胚珠；S2：将无菌的胚珠接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导和继代培养，得到以柑橘为原料的愈伤组织；S3：将愈伤组织接种到相应的液体培养基中振荡培养，得到性状稳定的悬浮细胞。本发明专利技术得到的愈伤组织性状稳定，诱导率高，能够得到高质量的愈伤组织，并且得到的悬浮细胞颗粒分散性好，溶液澄清透明。溶液澄清透明。

【技术实现步骤摘要】
一种柑橘愈伤组织和悬浮细胞的培养方法


[0001]本专利技术属于植物种苗快繁
，具体涉及一种柑橘愈伤组织和悬浮细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]柑橘为世界上最重要的水果之一，我国也是重要的原产地，当前许多优良品种均起源于我国。到目前为止我国的柑橘业已经取得了长足的进展，产量居世界第3位，但其中仍然存在许多问题。柑橘很多病害仍然是威胁柑橘产业的主要因素，抗病育种被视为解决病害问题的根本途径。因此，研究病菌与寄主互作机制，尤其是寄主抗性反应机制，从中挖掘抗/耐病相关的基因，利用耐病基因进行聚合育种(pyramiding tolerance/resistance genes)，是一条可行的途径。但由于柑橘获得转基因阳性植株时间较长，因此，柑橘愈伤组织是理化诱变和遗传转化的理想材料，诱导高频率的体细胞胚胎发生对于柑橘细胞的遗传转化、离体诱变、离体筛选突变体、快速繁殖等工作具有特别重要的意义，通过这种途径可以在较短的时间内获得大量的完整植株。因此，诱导柑橘愈伤组织及悬浮细胞培养具有重要的理论和实用价值。
[0003]广东省有丰富的柑橘种质资源，砂糖橘(Citrus reticulata Blanco)是广东省最具地方特色和优势的主栽柑橘品种，果肉爽脆，味甜多汁，深受广大群众的喜爱。但是，随着砂糖橘种植面积的迅速发展，一些生产和市场上所面临的问题也越来越多，市场竞争力正在逐年下降。因此，能够保存优秀的砂糖橘种质的砂糖橘愈伤组织的培养极为重要。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种柑橘愈伤组织和悬浮细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0005]S1：选取种子消毒后取出胚珠；
[0006]S2：将胚珠接种到愈伤组织培养基中诱导培养得到愈伤组织；
[0007]S3：从步骤S2的愈伤组织培养基中取定量的愈伤组织转移到相应的液体培养基中培养，获得胚性悬浮细胞悬液。
[0008]在本专利技术的一些实施方式中，所述愈伤组织培养基组成包括：
[0009]培养基母液A：90～100g/L KNO3，80～85g/L NH4NO3，16～20g/L MgSO4·
7H2O，5～10g/L KH2PO4，0.5～1.5g/L K2HPO4，4℃保存；
[0010]培养基母液B：0.6～0.64g/L硼酸，1.6～1.75g/L MnSO4·
H2O，0.7～1g/L ZnSO4·
7H2O，0.073～0.093g/L KI，0.015～0.035g/L Na2MoO4·
2H2O，0.0015～0.0035g/L CuSO4·
5H2O，0.0015～0.0035g/L CoCl2·
6H2O，4℃保存；
[0011]培养基母液C：8～12g/L肌醇，0.5～1.5g/L维生素B1，0.5～1.5g/L维生素B6，0.25～0.75g/L烟酸，0.1～0.3g/L甘氨酸，4℃保存；
[0012]培养基母液D：29～30g/L CaCl2·
2H2O，4℃保存；
[0013]培养基母液E：7.25～7.65g/L Na2‑
EDTA，5.47～5.67g/L FeSO4·
7H2O，4℃保存；
[0014]所述愈伤组织培养基配方为：18～20mL/L母液A，8～12mL/L母液B，8～12mL/L母液C，12～18mL/L母液D，2.5～7.5mL/L母液E，40～60g/L蔗糖，0.25～0.75g/L麦芽提取物，6～10g/L琼脂，pH值为5.5～6.5。
[0015]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述愈伤组织培养基组成包括：
[0016]培养基母液A：95g/L KNO3，82.5g/L NH4NO3，18.5g/L MgSO4·
7H2O，7.5g/L KH2PO4，1g/L K2HPO4，4℃保存；
[0017]培养基母液B：0.62g/L硼酸，1.68g/L MnSO4·
H2O，0.86g/L ZnSO4·
7H2O，0.083g/L KI，0.025g/L Na2MoO4·
2H2O，0.0025g/L CuSO4·
5H2O，0.0025g/L CoCl2·
6H2O，4℃保存；
[0018]培养基母液C：10g/L肌醇，1g/L维生素B1，1g/L维生素B6，0.5g/L烟酸，0.2g/L甘氨酸，4℃保存；
[0019]培养基母液D：29.33g/L CaCl2·
2H2O，4℃保存；
[0020]培养基母液E：7.45g/L Na2‑
EDTA，5.57g/L FeSO4·
7H2O，4℃保存；
[0021]所述愈伤组织培养基配方为：20mL/L母液A，10mL/L母液B，10mL/L母液C，15mL/L母液D，5mL/L母液E，50g/L蔗糖，0.5g/L麦芽提取物，8g/L琼脂，pH值为5.8。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述液体培养基组成包括：
[0023]培养基母液F：140～160g/L KCl，35～40g/L MgSO4·
7H2O，10～17g/L KH2PO4，1.5～3g/L K2HPO4，4℃保存；
[0024]所述液体培养基配方为：8～12mL/L母液A，3～7mL/L母液F，8～12mL/L母液B，8～12mL/L母液C，10～20mL/L母液D，3～8mL/L母液E，30～40g/L蔗糖，0.25～0.75g/L麦芽提取物，1.45～1.65g/L谷氨酰胺，pH值为5.5～6.5。
[0025]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述液体培养基组成包括：
[0026]母液F：150g/L KCl，37g/L MgSO4·
7H2O，15g/L KH2PO4，2g/L K2HPO4，4℃保存；
[0027]所述液体培养基配方为：10mL/L母液A，5mL/L母液F，10mL/L母液B，10mL/L母液C，15mL/L母液D，5mL/L母液E，35g/L蔗糖，0.5g/L麦芽提取物，1.55g/L谷氨酰胺，pH值为5.8。
[0028]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S1所述消毒的具体方法为将种子放于20％次氯酸钠中20～40min。
[0029]在本专利技术的一些优选的实施方式中，步骤S1所述消毒的具体方法为将种子放于20％次氯酸钠中30min。
[0030]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S1所述种子为未成熟的种子，未发育成熟的种子分化性，生长性能好，能够很快分化形成愈伤细胞。
[0031]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S2所述愈伤组织的培养条件为：温度26～30℃，湿度70％～80％，暗培养。
[0032]在本专利技术的一些优选的实施方式中，步骤S2所述愈伤组织的培养条件本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种柑橘愈伤组织和悬浮细胞的培养方法，包括以下步骤：S1：选取种子消毒后取出胚珠；S2：将胚珠接种到愈伤组织培养基中诱导培养得到愈伤组织；S3：从步骤S2的愈伤组织培养基中取定量的愈伤组织转移到相应的液体培养基中培养，获得胚性悬浮细胞悬液。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述愈伤组织培养基组成包括：培养基母液A：90～100g/L KNO3，80～85g/L NH4NO3，16～20g/L MgSO4·
7H2O，5～10g/L KH2PO4，0.5～1.5g/L K2HPO4，4℃保存；培养基母液B：0.6～0.64g/L硼酸，1.6～1.75g/L MnSO4·
H2O，0.7～1g/L ZnSO4·
7H2O，0.073～0.093g/L KI，0.015～0.035g/L Na2MoO4·
2H2O，0.0015～0.0035g/L CuSO4·
5H2O，0.0015～0.0035g/L CoCl2·
6H2O，4℃保存；培养基母液C：8～12g/L肌醇，0.5～1.5g/L维生素B1，0.5～1.5g/L维生素B6，0.25～0.75g/L烟酸，0.1～0.3g/L甘氨酸，4℃保存；培养基母液D：29～30g/L CaCl2·
2H2O，4℃保存；培养基母液E：7.25～7.65g/L Na2‑
EDTA，5.47～5.67g/L FeSO4·
7H2O，4℃保存；所述愈伤组织培养基配方为：18～20mL/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕远达，姜波，闫化学，钟云，
申请(专利权)人：广东省农业科学院果树研究所，
类型：发明
国别省市：