一种鸡胚胸肌成肌细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术涉及一种鸡胚胸肌成肌细胞的分离培养方法。发明专利技术利用胰蛋白酶消化剪碎后的鸡胚胸肌到成肌细胞培养，短时间胰蛋白酶消化不会对成肌细胞活性造成明显损伤，可以得到活性较好的成肌细胞；结合采用差速贴壁法，进一步提高了细胞纯度；原代成肌细胞培养24h后细胞即可贴壁，48h后即可长满培养皿80％以上进行传代；细胞生长旺盛，获得的细胞具有分化为肌纤维和肌肉的能力，可为探究肉鸡肌纤维生长和分型等肌肉发育调控的机理研究提供实验材料。型等肌肉发育调控的机理研究提供实验材料。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡胚胸肌成肌细胞的分离培养方法


[0001]本专利技术涉及一种鸡胚胸肌成肌细胞分离培养方法，属于生物
的细胞分离培养方法。

技术介绍

[0002]骨骼中的肌细胞起源于间充质干细胞，肌肉间充质干细胞经过系谱定向成为成肌细胞，随后分化形成肌纤维。干细胞的系谱定向通过内源性信号和外源性信号共同调控，而间充质干细胞对成肌细胞的分化，影响肌纤维的数目、类型和横截面积，骨骼肌组织的发生和发育是决定肉品质的重要基础。骨骼肌的发生是一个非常复杂的过程，是涉及众多相关功能基因有序、可控表达的结果。包括成肌细胞的基因组的转录和表达，同时也受生长因子、细胞外基质和细胞之间相互接触的影响。当成肌细胞开始分化为肌纤维时，需要激活特定的关键诱导因子
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生肌调节因子，决定了骨骼肌的形成。因此，成肌细胞可以作为肌肉发育的理想载体，通过体外成肌细胞培养试验来探究骨骼肌生长发育机理，同时，观察鸡胚成肌细胞增殖和分化过程，进行肌纤维生肌调控因子和蛋白表达通路的研究，是探究鸡肌纤维生长和发育的理想模型。
[0003]目前，鸡胚成肌细胞原代分离主要通过传统酶消化法——双酶消化法，根据细胞贴壁速度的快慢，利用细胞的物理特性对细胞进行纯化。传统酶消化法需要两种不同的消化酶对肌肉组织进行消化，操作步骤繁琐，且需用到大量试验仪器和耗材，耗时长，使用这种方法培养结果往往不能达到要求，导致细胞培养效率低纯度差的原因可能有以下几点：1、鸡胚胸肌较小，未发育完全的筋膜和骨头镶嵌在胸肌中，分离时容易被忽略，要分离出纯粹的胸肌进行消化培养较为困难。2、原代成肌细胞十分脆弱，对消化酶十分敏感，当组织经过多种酶长时间消化和高速离心后，对细胞损伤大，降低细胞活性，健康细胞得率低。3、传统酶消化法分离原代鸡胚胸肌成肌细胞时，操作步骤复杂，需要准备和使用大量耗材，增加成本。因此，如何高效率、高质量和低成本的快速分离出活性高、数量多的成肌细胞是研究鸡肌纤维形成和生长的关键技术问题，对进一步探究通过营养手段调控家禽肌肉生长发育的机理具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术中存在的不足之处，提供一种快速获得高质量、高数量和低成本的鸡胚成肌细胞分离培养方法，为探究鸡肌纤维形成和生长提供优质实验材料，对进一步调控家禽肌肉发育的机理打下坚实基础。
[0005]本专利技术的技术方案如下：
[0006]鸡胚处理选取发育良好的12胚龄鸡胚(图1)，用75％酒精喷拭消毒3遍后，放置于超净台内，取用第一套镊子敲击鸡胚钝端气室，用镊子小心取出鸡胚；使用添加1％双抗的PBS冲洗鸡胚。
[0007]收集胸肌取用第二套小镊子背部轻轻揭开鸡胚胸肌皮肤，使胸肌完全裸露出来；
使用第三套镊子小心夹起一侧胸肌，向上微提，用第一套眼科手术剪小心围绕镊子剪下胸肌，随后用同样的方法采集另一侧胸肌，将剪下的胸肌放置于第一套盛有含1％双抗的PBS的培养皿内保持湿润；用第四套镊子寻找胸肌周围的筋膜和内部脆骨，用第二套眼科手术剪刀小心剔除筋膜和脆骨，把纯胸肌置于第二套盛有含1％双抗的PBS的培养皿中清洗3遍后，将胸肌置于2mL高糖培养基中，用眼科手术弯剪修剪为体积为1mm3大小的肉块。
[0008]胸肌消化将剪碎后的胸肌移入15mL离心管中，800g离心5min，吸弃上清液，用胰蛋白酶溶液将剪碎后的肌肉在37℃消化2
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5min，消化过程中看不到明显肉团，胰蛋白酶颜色变浅变混浊，溶液呈略微粘稠状态，加入等体积细胞培养液终止消化。
[0009]过滤，离心将直径为100μL的一次性无菌细胞筛网置于50mL离心管上进行过滤，把混合液通过筛网流入离心管中，把过滤后的细胞混液加入新的15mL离心管中，200g离心3min，吸弃上清液，得到的下层沉淀即为细胞。
[0010]接种，纯化将上步获得的细胞中加入1mL细胞培养液重悬浮，将细胞悬液接种到含10mL DMEM细胞培养液的直径为10cm的细胞培养皿中，使用8字摇匀法使细胞均匀分布在细胞培养皿中，在光学显微镜下观察到细胞在培养皿中均匀分布后放入温度为37℃，二氧化碳含量为5％的细胞培养箱中正常培养；40min后将未贴壁的细胞同细胞培养液一起移入新的细胞培养皿中，差速贴壁2次后，即可得到纯度较高的成肌细胞，进行原代培养。
[0011]培养，传代上步所得原代成肌细胞在细胞培养液中继续原代培养48h后(图2)即可进行传代，在细胞培养皿中加入1mL胰蛋白酶，1min后加入2mL细胞培养液终止消化，500g离心3min，吸弃上清液，下层沉淀即为所需的成肌细胞；加入2mL细胞培养液重悬浮，吸取20μL悬浮液滴入细胞计数板计数，根据计数结果，按照试验方案将细胞悬浮液接种到加入细胞培养液的细胞培养皿中进行试验。
[0012]本专利技术所提供的方法选取12胚龄鸡胚胸肌，胸肌处理先用眼科手术弯剪剔除骨头和筋膜，随后将胸肌剪碎，剪碎后的胸肌全部置于胰蛋白酶溶液中在37℃水浴消化，这样处理能够在一定程度上剔除骨细胞和其他细胞，加快成肌细胞爬出速度和纯度，减少成肌细胞在胰蛋白酶中的消化时间，降低胰蛋白酶对成肌细胞的损害。关于鸡胚胸肌剪碎后用胰蛋白酶处理的方法与传统酶消化法相比来说能够更快的进行成肌细胞纯化处理，因为传统酶消化法需要先用胶原酶消化肌肉后，再加入胰蛋白酶消化，长时间的酶消化会降低成肌细胞活性，而剔除骨头和筋膜后将胸肌剪碎立即用胰蛋白酶消化2
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5min，不仅达到了去除杂质细胞，使成肌细胞快速爬出的目的，且短时间的胰蛋白酶消化不会对成肌细胞活性造成太大影响，能够快速得到活性高的成肌细胞进行培养。
[0013]本专利技术所用PBS为无酚红、无钙和无镁的磷酸盐缓冲盐水，高糖培养基为含4.5g/LD
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Glucose培养基(含酚红),胰蛋白酶为0.25％Trypsin
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EDTA,双抗含量为10000Units/mL penicillin、10000ug/mL streptomycin,胎牛血清等均购自gibco。
[0014]本专利技术的新的技术效果
[0015]本专利技术所提供的方法具有以下优点：
[0016]1.操作简单，价格低廉。利用胰蛋白酶消化剪碎后的鸡胚胸肌到成肌细胞培养，免去了传统酶消化法繁冗步骤和时间，只需用到少数仪器和胰蛋白酶，节省仪器和试剂费用，降低成本。
[0017]2.细胞活性好，纯度高。利用胰蛋白酶法消化鸡胚胸肌，在短时间内迅速得到大量
成肌细胞，且短时间胰蛋白酶消化不会对成肌细胞活性造成大的损伤，可以得到活性较好的成肌细胞，另外结合差速贴壁法，进一步提高了细胞纯度。且对原代成肌细胞培养后可以获得足够数量的成肌细胞，满足试验要求。
[0018]3.生长周期短，结果重复性好。培养的成肌细胞生长活性好，周期短，原代成肌细胞培养24h后即可看见细胞贴壁，48h后即可长满培养皿80％以上进行传代，生长旺盛。
[0019]4.本专利技术使用鸡胚胸肌进行原代成肌细胞分离和传代培养，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸡胚胸肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于所述方法包括鸡胚处理、收集胸肌、胸肌消化、过滤离心、接种纯化、培养传代步骤，其中：所述收集胸肌为取发育良好的12胚龄胚用含1％双抗的PBS溶液冲洗3次，去头，冲洗干净，剪取出两侧胸肌；所述胸肌消化、过滤离心为将取出的胸肌置于含1％双抗的PBS中，剔除肌肉周围骨头和筋膜，在PBS溶液中清洗后，置于2mL高糖培养基中，将胸肌肉修剪成体积为1mm3大小的肉块按每枚胚蛋加入0.5mL胰蛋白酶，37℃水浴锅中消化2
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5min；待溶液变混...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海军，王源昊，胡著然，王丽荣，申小冉，宁尚锴，王晶，武书庚，邱凯，林静，马友彪，齐广海，杨林林，
申请(专利权)人：山东碧蓝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：