一种外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用技术

本发明专利技术提供一种外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用。所述制备方法包括以下步骤：(1)采用胰蛋白酶消化液对自体脂肪组织消化后，清洗，得到脂肪细胞；(2)将步骤(1)得到的脂肪细胞置于培养基中培养，得到细胞悬液；(3)将步骤(2)得到的细胞悬液与氨甲环酸混合后培养，收集，得到氨甲环酸修饰的自体间充质脂肪干细胞产生的外泌体。该外泌体制剂的有效成分包括自体间充质脂肪干细胞产生的外泌体及氨甲环酸的修饰，且烧伤创面修复的外泌体制剂，需要能够促进创面愈合、并降低创面的黑色素沉着，减少创面愈合后的痕迹。减少创面愈合后的痕迹。减少创面愈合后的痕迹。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用。

技术介绍

[0002]皮肤烧伤属于开放性的病理损害，烧伤可致皮肤结构与功能的破坏，烧伤后皮肤的愈合是复杂的生理过程，先后经历出血后的止血、炎症反应、增生、组织改建及瘢痕过程，该过程中需多种组织细胞参与，如上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞等。烧伤创面因存在大量烧伤毒素并暴露于复杂的微生物环境中，适当的炎性细胞参与可降低感染风险，但过度的炎性反应则影响烧伤创面的愈合。
[0003]对于大面积烧伤患者，因自体皮肤来源缺乏，自体皮肤移植受限；异体来源的皮肤不仅有限，且存在免疫排斥等问题，亟待新的创面修复技术用于烧伤患者的抢救、皮肤功能恢复、瘢痕的淡化。脂肪来源的间充质干细胞是一种分布广泛、取材方便、具有一定的自我更新和分化潜能的多能干细胞，能够分泌多种促进组织修复、调节组织微环境、消炎、抗纤维化的细胞因子。尽管脂肪间充质干细胞的安全性较高，但完整结构的干细胞仍具备一定的致瘤风险，脂肪间充质干细胞来源的外泌体则兼顾了安全性与有效性。脂肪间充质干细胞来源的外泌体能够将干细胞的核酸、蛋白、脂质及信号分子转运给靶细胞，发挥类似于干细胞在烧伤创面修复中的功能。
[0004]CN113018501A公开了一种内皮祖细胞外泌体医用敷料、制备方法及其应用，包括以下步骤：三维培养得到内皮祖细胞、采用内皮祖细胞制备外泌体、通过外泌体得到外泌体医用敷料。该专利技术所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料，以健康的脐带血内皮祖细胞为原料，包含高活力的外泌体，纳米级的磷脂囊泡中包裹着和细胞生长、修复等功能密切相关的数百种蛋白质和microRNA等生物活性分子，通过激活患者机体的内源性组织特异性干细胞、建立组织损伤修复的再生微环境，促进烧伤、烫伤等疾病的伤口组织修复。
[0005]CN111671772A公开了一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用，属于皮肤治疗
该专利技术从原代鹿茸组织中分离获得间充质干细胞；经体外扩大培养，收集细胞培养液，经分离提取获得鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。经证实，能够通过NLRP3炎症小体信号通路抑制LPS诱导的HaCat细胞的炎症反应，能够加快皮肤损伤小鼠模型的创面修复、减轻炎症反应。本专利技术可用于制备治疗皮肤损伤修复药物或化妆品。
[0006]CN110693912A公开了一种细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用。该专利技术干细胞外泌体无免疫原性、无致瘤性，提取方法成熟、保存方便，将其贴附压疮皮肤，可降低创面组织中肌成胶原纤维含量、I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白和/或HMGB1和/或TGF
‑
β表达量，进而促进创面愈合。该专利技术使用外泌体替代因免疫原性、致瘤性原因导致临床使用严格的干细胞，消除干细胞治疗的局限性，且能达到相应治疗效果。
[0007]因此，提供一种自体脂肪间充质干细胞的外泌体制备和修饰方法，可用于促进皮肤烧伤患者的创面修复、消炎、淡化瘢痕是本领域的研究重点。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用，特别涉及一种氨甲环酸修饰的自体间充质脂肪干细胞产生的外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用。
[0009]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种外泌体的制备方法，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：
[0011](1)采用胰蛋白酶消化液对自体脂肪组织消化后，清洗，得到脂肪细胞；
[0012](2)将步骤(1)得到的脂肪细胞置于培养基中培养，得到细胞悬液；
[0013](3)将步骤(2)得到的细胞悬液与氨甲环酸混合后培养，收集，得到氨甲环酸修饰的自体间充质脂肪干细胞产生的外泌体。
[0014]在本专利技术中，所述外泌体的制备中，外泌体的来源为自体脂肪间充质干细胞，能够将干细胞的核酸、蛋白、脂质及信号分子转运给靶细胞，发挥类似于干细胞在烧伤创面修复中的功能。
[0015]优选地，步骤(1)中，所述胰蛋白酶消化液和自体脂肪组织的体积比为(15
‑
25):(25
‑
50)；
[0016]其中，“15
‑
25”例如可以是15、17、19、21、23、25等；
[0017]其中，“25
‑
50”例如可以是25、30、35、40、45、50等。
[0018]优选地，步骤(1)中，所述胰蛋白酶消化液包括：胰蛋白酶和EDTA溶液。
[0019]优选地，所述胰蛋白酶消化液中胰蛋白酶的质量百分含量为0.05
‑
0.2％，例如可以是0.05％、0.1％、0.15％、0.2％等。
[0020]优选地，所述EDTA溶液的浓度为0.05
‑
0.15mM，例如可以是0.05mM、0.06mM、0.1mM、0.12mM、0.15mM等。
[0021]优选地，所述EDTA溶液的pH为7.5
‑
8.5，例如可以是7.5、7.6、7.8、8.0、8.2、8.5等。
[0022]优选地，步骤(1)中，所述自体脂肪组织为自体腹部脂肪组织。
[0023]优选地，步骤(1)中，所述消化具体包括以下步骤：将自体脂肪组织与部分胰蛋白酶消化液混合，进行一次消化，收集部分消化细胞悬浮液；再将剩余未消化的自体脂肪组织与剩余胰蛋白酶消化液混合，进行二次消化，合并收集，得到消化细胞悬浮液。
[0024]优选地，所述自体脂肪组织、部分胰蛋白酶消化液、剩余胰蛋白酶消化液的体积比为(15
‑
25):(15
‑
30):(10
‑
20)；
[0025]其中，“15
‑
25”例如可以是15、17、19、21、23、25等；
[0026]其中，“15
‑
30”例如可以是15、20、25、30等；
[0027]其中，“10
‑
20”例如可以是10、12、14、16、18、20等。
[0028]优选地，所述一次消化的温度为36.5
‑
38℃，例如可以是36.5℃、37℃、37.5℃、38℃等，所述一次消化的时间为8
‑
12min，例如可以是8min、9min、10min、11min、12min等。
[0029]优选地，所述二次消化的温度为36.5
‑
38℃，例如可以是36.5℃、37℃、37.5℃、38℃等，所述二次消化的时间为4
‑
10min，例如可以是4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min等。
[0030]优选地，所述清洗具体包括以下步骤：将消化细胞悬浮液离心后，弃去上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)采用胰蛋白酶消化液对自体脂肪组织消化后，清洗，得到脂肪细胞；(2)将步骤(1)得到的脂肪细胞置于培养基中培养，得到细胞悬液；(3)将步骤(2)得到的细胞悬液与氨甲环酸混合后培养，收集，得到氨甲环酸修饰的自体间充质脂肪干细胞产生的外泌体。2.根据权利要求1所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述胰蛋白酶消化液和自体脂肪组织的体积比为(15
‑
25):(25
‑
50)；优选地，步骤(1)中，所述胰蛋白酶消化液包括：胰蛋白酶和EDTA溶液；优选地，所述胰蛋白酶消化液中胰蛋白酶的质量百分含量为0.05
‑
0.2％；优选地，所述EDTA溶液的浓度为0.05
‑
0.15mM；优选地，所述EDTA溶液的pH为7.5
‑
8.5；优选地，步骤(1)中，所述自体脂肪组织为自体腹部脂肪组织。3.根据权利要求1或2所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消化具体包括以下步骤：将自体脂肪组织与部分胰蛋白酶消化液混合，进行一次消化，收集部分消化细胞悬浮液；再将剩余未消化的自体脂肪组织与剩余胰蛋白酶消化液混合，进行二次消化，合并收集，得到消化细胞悬浮液；优选地，所述自体脂肪组织、部分胰蛋白酶消化液、剩余胰蛋白酶消化液的体积比为(15
‑
25):(15
‑
30):(10
‑
20)；优选地，所述一次消化的温度为36.5
‑
38℃，一次消化的时间为8
‑
12min；优选地，所述二次消化的温度为36.5
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38℃，二次消化的时间为4
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10min；优选地，所述清洗具体包括以下步骤：将消化细胞悬浮液离心后，弃去上清液，加入PBS缓冲液，震荡清洗，得到脂肪细胞；优选地，所述离心的转速为800
‑
1500rpm，离心的时间为2
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5min；优选地，所述震荡清洗的次数为至少两次。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养基为无血清培养基；优选地，步骤(2)中，所述脂肪来源细胞的接种量为15
‑
25cm3；优选地，步骤(2)中，所述培养的温度为36.5
‑
38℃，培养的气体为5％的二氧化碳，培养的时间为20
‑
28h。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述细胞悬液与氨甲环酸的体积与质量比为(20<...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海源，卢俊锋，陈晓冬，
申请(专利权)人：三代康年上海医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：