猪血小板裂解液培养基及其应用制造技术

本发明专利技术涉及细胞培养基的技术领域，具体涉及一种利于猪细胞在体外培养扩增的细胞培养基。本发明专利技术是在细胞培养基的配制中加入猪血小板裂解液，可以保证细胞在体外培养时细胞的增殖能力，同时也保证了成纤维细胞或间充质干细胞在体外培养扩增时不受外源性的污染，也免于异体细胞治疗疾病时的免疫排斥，有利于在临床上用自体细胞治疗自身疾病的应用。上用自体细胞治疗自身疾病的应用。上用自体细胞治疗自身疾病的应用。

【技术实现步骤摘要】
猪血小板裂解液培养基及其应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养基的
，具体涉及动物细胞培养中的应用。

技术介绍

[0002]细胞培养添加物是一类为细胞生长提供所需激素、蛋白质、生长因子和微量化学物质的材料统称，从品类上通常可以分为血清与血清替代物三大类。目前应用中常见的细胞培养添加物主要有血清、PL(血小板裂解液)和无血清培养基。其中以FBS为代表的血清类材料作为培养添加物在应用中最为常见。
[0003]PL是富血小板血浆的衍生物，是将浓缩血小板进一步裂解后所获得的液体成分，因其成分复杂，存在FBS等血清类材料存在的问题。相关研究表明早在20世纪80年代人PL用于培养已建立的细胞系、肿瘤细胞或关节软骨细胞。人PL已成功用于间充质干细胞的培养和脂肪来源基质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、单核细胞、人牙龈成纤维细胞等多种细胞的培养。PL应用最为广泛的是间充质干细胞的培养，相关研究基本都基于人PL在细胞培养中的应用，其他动物源性PL的研究数量极少。
[0004]随着再生医学和细胞疗法的发展，细胞培养的要求也在相应增加。除了人以外，各种模式动物的细胞培养要求也在相应增高。相同物种的 PL可以有效避免异种间的异源感染问题。2018年爆发非洲猪瘟对地方猪遗传资源安全造成重大威胁，为避免猪遗传资源丢失，国家大力推进地方猪遗传资源保护工作，专利技术人参与了安徽省地方猪遗传资源保护，其中很重要的一项便是保存猪体细胞，以便于在未来可以通过体细胞克隆与胚胎移植技术重新建立良好的地方猪种质资源。然而保存体细胞涉及细胞分离培养，目前为止多选用FBS分离培养猪的体细胞，然而在未来对体细胞进行克隆与移植将会产生异种免疫反应，使用同源的 PL则可避免此类问题的发生。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了猪血小板裂解液(PPL)替代胎牛血清(FBS)用于猪细胞培养，保证了成纤维细胞或骨髓间充质干细胞在体外培养扩增时不受外源性的污染，也免于异体细胞治疗疾病时的免疫排斥。
[0006]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
[0007]本专利技术提供一种用于猪成纤维细胞或间充质干细胞在体外培养扩增的细胞培养基，其特征在于，该培养基包含1
‑
10％的猪血小板裂解液。
[0008]优选地，基础培养基可以为DMEM高糖培养基或αMEM基础培养基。
[0009]优选地，该培养基包含5
‑
8％的猪血小板裂解液.
[0010]更进一步地，该培养基包含非必须氨基酸和/或GlutaMax。
[0011]本专利技术还提供一种猪血小板裂解液在细胞培养中的应用。所述细胞为成纤维细胞和间充质干细胞。优选地，所述成纤维细胞为猪胎儿成纤维细胞(PEF)或猪成体成纤维细胞(PAF)。更优选地，所述间充质干细胞为猪脂肪间充质干细胞(PAMSC)或猪骨髓间充质干细
胞(PBMSC)。
[0012]特别地，培养基中猪血小板裂解液的添加浓度为1
‑
10％，优选5
‑
8％。
[0013]本专利技术还提供一种猪血小板裂解液的制备方法，包括以下步骤：
[0014](1)采集猪血小板和猪血浆；
[0015](2)离心去除步骤(1)中猪血浆中的纤维蛋白原；
[0016](3)将猪血小板重悬于已离心去除纤维蛋白原的血浆中；
[0017](4)将步骤(3)得到的样品反复冻融，离心后收集上清液，即为血小板裂解液。
[0018]优选地，所述步骤(1)包括以下步骤，
[0019]a.选取健康待宰生猪，在屠宰时收集血液；
[0020]b.将步骤a采集的抗凝猪血液转移到第一离心管中，离心观察到血液分层；
[0021]c.取第一离心管中部分富血小板血浆(PRP)层转移到第二离心管中；
[0022]d.将步骤c取完部分PRP层剩余的液体，按照1
‑
3:1
‑
3的比例添加缓冲液，将离心管倒置混匀；对离心管进行离心，将上清液转移到另一离心管中；
[0023]e.将步骤d中离心管得到的上清液体进行富集、并离心，得到血小板颗粒；
[0024]f.对第二离心管中液体进行富集、并离心，得到血小板颗粒和血浆；
[0025]g.将上述步骤e或步骤f得到的血小板颗粒冷冻保存。
[0026]优选地，所述猪血小板裂解液的制备方法步骤(4)中，在
‑
80℃和 4℃条件反复冻融2
‑
5次。
[0027]优选地，所述步骤b)、步骤d)离心条件为以100
‑
200g离心15
‑
20min；步骤e)、步骤f)离心条件为在20
‑
22℃下以2500
‑
3200r离心15
‑
30min。
[0028]优选地，将步骤f得到的血浆过滤除菌，冷冻保存；优选地，将步骤f得到的血浆经0.22μm滤器过滤除菌。
[0029]优选地，在步骤a收集血液中，优选地，所述抗凝剂为CPDA
‑
1枸橼酸钠类抗凝剂；将抗凝剂与血液体积以28:200混合均匀。
[0030]优选地，步骤(3)中所述去除纤维蛋白原采用的物质为无机钙化合物，优选为氯化钙；优选地，血浆中CaCl2添加浓度为9.3
‑
21.7mmol/L；优选为9.3mmol/L。
[0031]本专利技术还提供了根据上述制备方法制得的猪血小板裂解液。
[0032]本专利技术通过实验表明，与FBS相比，PPL培养的间充质干细胞与成纤维细胞表现出纺锤形拉长的形态，具有较高的增殖指标，相似的分化(CD)标记簇，在分化谱系(骨细胞、软骨细胞)中没有明显的变异。因此我们完全可以制备PPL代替FBS培养，特别是在相同物种细胞培养方面。
附图说明
[0033]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0034]图1为猪血小板分离流程；
[0035]图2为本专利技术通过在不同培养条件下观察到的对细胞形态学的影响(Scalebar:250μm)；
[0036]图3为PAF、PEF、PAMSC和PBMSC细胞生长曲线；
[0037]图4为PAF、PEF、PAMSC和PBMSC细胞传代增殖曲线；
[0038]图5为PAF、PEF、PAMSC和PBMSC细胞连续传代倍增时间；
[0039]图6为本专利技术PAF细胞免疫荧光染色；
[0040]图7为PAMSC细胞免疫荧光染色；
[0041]图8为PAMSC和PBMSC阿利新蓝染色；
[0042]图9为猪血浆凝固程度
具体实施方式
[0043]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于猪成纤维细胞或间充质干细胞在体外培养扩增的细胞培养基，其特征在于，该培养基包含1
‑
10％的猪血小板裂解液。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，基础培养基为DMEM高糖培养基或αMEM基础培养基。3.根据权利要求1所述的培养基，该培养基包含5
‑
8％的猪血小板裂解液。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的培养基，其特征在于，该培养基包含非必须氨基酸和/或GlutaMax。5.一种猪血小板裂解液在细胞培养中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞为成纤维细胞和/或间充质干细胞。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述成纤维细胞为猪胎儿成纤维细胞或猪成体成纤...

【专利技术属性】
技术研发人员：于童，马洋洋，潘欠欠，罗鹏飞，朱娜娜，项天宇，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：