心肌特异性甲基化标记物制造技术

本发明专利技术涉及心脏特异性游离DNA甲基化标志物及其在急性心肌梗死诊断中的用途。具体而言，本发明专利技术涉及用于检测CGI区域的正向引物和反向引物以及探针。本发明专利技术还涉及包含所述引物和探针的组合物、试剂盒。本发明专利技术利用MCTA

【技术实现步骤摘要】
心肌特异性甲基化标记物


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，并具体涉及心脏特异性游离DNA甲基化标志物及其在急性心肌梗死诊断相关领域中的用途。

技术介绍

[0002]心血管疾病(包括急性心肌梗死(AMI))是世界范围内主要的死亡原因。心肌梗死与心肌细胞的死亡有着密切的关系。心肌细胞发生损伤时可在血液中检测到心肌肌钙蛋白。在现有的AMI诊断方式中，超敏肌钙蛋白(hs
‑
cTn)被广泛用于AMI诊断，但是其对早期AMI患者的诊断准确率不够高。
[0003]越来越多的研究显示，循环游离DNA(circulating cell
‑
free DNA，cfDNA)已经日益成为诊断和监测疾病的有力工具。目前，cfDNA已成功用于临床无创产前检查和肿瘤液体活检，并且cfDNA在移植排斥中的应用也处于正在进行的研究之中。但是，这种基于基因的诊断工具不适用于其中cfDNA来源于具有正常基因组的组织。
[0004]先前的研究表明，AMI患者的cfDNA浓度较正常人升高，并且系列采样显示cfDNA的峰值通常晚于肌酸激酶(CK)
‑
MB(CK
‑
MB，其是CK的三种同功酶之一)，但是增加的cfDNA的来源尚不清楚。
[0005]在最近一项里程碑式的研究中，Zemmour等研究人员证实了来自垂死的心肌细胞的DNA能够以cfDNA的形式释放到血液中。
[0006]另据报道，标志物FAM101A是心肌细胞中细胞类型特异性的非甲基化标志物，并且在干预和经皮冠状动脉介入治疗(PCI)之前，AMI患者血浆中的非甲基化FAM101A水平升高。相对于非甲基化的标志物，肿瘤或组织特异性的高甲基化标志物的研究更为广泛，但目前尚无心脏特异性高甲基化标志物的报道。另外，尽管Zemmour等已经报道了FAM101A的微滴式数字PCR(ddPCR)分析，但由于非甲基化CpG位点之间的距离过长，因此效果仍欠佳。作为稳定的组织特异性表观遗传学修饰，DNA甲基化最近已经被研究用于评估cfDNA的组织来源。在血浆cfDNA组织来源的研究过程中，研究人员已经建立了使用全基因组和靶标富集DNA甲基化方法对组织部分进行反卷积分析的算法。
[0007]此外，由于心血管疾病诊断的需要较高的时效性，因而开发出针对心脏特异性标志物的快速简单的PCR方法非常重要。因此，在心血管疾病的诊断中，仍然存在对能够早期检测AMI的快速简单且有效的检测方法的需要。

技术实现思路

[0008]本专利技术利用基于基因组DNA的甲基化测序技术，甲基化CpG串联扩增和测序(MCTA
‑
Seq)，探索心脏特异性的高甲基化标志物，以有效检测血液中的心脏损伤信号。本专利技术通过比较健康受试者的心脏、肝脏组织、白细胞和血浆的所有CpG岛(CpG island,CGI)位点的MCTA
‑
Seq甲基化测序数据来选择潜在的心脏特异性标志物。本专利技术鉴定了CGI_CORO6基因座为心脏特异性高甲基化标志物，设计了相应的ddPCR测定，其能够有效检测AMI。本专利技术还
发现PCI术后升高的总cfDNA水平来自心脏和白细胞(WBC)。
[0009]在一方面，本专利技术涉及用于在个体中评估患有心血管疾病的风险或检测心血管疾病的DNA甲基化标志物集，所述标志物集包括一个或多个如表1所记载的CGI区域，其中相对于对照而言，所述个体中一个或多个CGI区域的较高的甲基化水平指示所述个体具有患有心血管疾病的风险或患有心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死。
[0010]在一个实施方案中，所述甲基化标志物包括如表1所记载的5个CGI区域。
[0011]在另一方面，本专利技术涉及检测生物样品中一个或多个CGI区域的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估个体中患有心血管疾病的风险或检测心血管疾病，所述评估包括在来自所述个体的生物样品中检测一个或多个CGI区域并将所述CGI区域的甲基化水平与对照进行比较，其中所述CGI区域的具体信息如表1所记载，其中相对于对照而言，一个或多个所述CGI区域的较高的甲基化水平指示所述个体具有患有心血管疾病的风险或患有心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死。
[0012]在一个实施方案中，所述生物样品是选自血液、全血或血浆的生物样品；任选地，所述生物样品是包含循环游离DNA(circulating cell
‑
free DNA，cfDNA)的样品。
[0013]在又一方面，本专利技术涉及用于检测CGI区域的引物，所述引物扩增如表1所记载的CGI区域中的一个或多个CGI区域，任选地，引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物用于检测CGI_CORO6区域；任选地，所述正向引物包含5
’‑
GGGAGATTAGAATTTTTGGAGTTTAGG
‑3’
，所述反向引物包含5
’‑
CGAAACTCGCAATCCAACCTC
‑3’
。
[0014]在另一方面，本专利技术涉及检测生物样品中一个或多个CGCGCGG
‑
CpG区域的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测个体中一个或多个CGI区域，所述检测包括：
[0015]1)从个体中提取DNA样品；
[0016]2)扩增至少一个CGI区域，所述CGI区域选自如表1所记载的区域；
[0017]3)测定所述CGI区域的甲基化水平，其中相对于对照而言，所述个体中一个或多个CGI区域的较高的甲基化水平指示所述个体具有患有心血管疾病的风险或患有心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死。
[0018]在另一方面，本专利技术涉及用于检测生物样品中一个或多个CGI区域的甲基化水平的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求5所述的引物和扩增DNA所需的一种或多种试剂，所述试剂选自扩增缓冲液、dNTP和扩增DNA所需的酶；其中所述试剂盒用于诊断心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死。
[0019]在又一方面，本专利技术涉及检测生物样品中一个或多个CGI区域的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估个体中评估患有心血管疾病的风险或检测心血管疾病，其中所述CGI区域选自如表1所记载的CGI区域，其中相对于对照而言，所述个体中一个或多个CGI区域的较高的甲基化水平指示所述个体具有患有心血管疾病的风险或患有心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死。
[0020]在另一方面，本专利技术涉及检测生物样品中一个或多个DNA区域的甲基化水平的试
剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估个体中评估患有心血管疾病的风险或检测心血管疾病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于在个体中评估患有心血管疾病的风险或检测心血管疾病的DNA甲基化标志物集，所述标志物集包括一个或多个如表1所记载的CGI区域，其中相对于对照而言，所述个体中一个或多个CGI区域的较高的甲基化水平指示所述个体具有患有心血管疾病的风险或患有心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死；又进一步任选地，所述标志物集包括如表1所记载的5个CGI区域。2.检测生物样品中一个或多个CGI区域的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估个体中患有心血管疾病的风险或检测心血管疾病，所述评估包括在来自所述个体的生物样品中检测一个或多个CGI区域并将所述CGI区域的甲基化水平与对照进行比较，其中所述CGI区域的具体信息如表1所记载，其中相对于对照而言，一个或多个所述CGI区域的较高的甲基化水平指示所述个体具有患有心血管疾病的风险或患有心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死；又进一步任选地，所述评估包括检测如表1所记载的5个CGI区域；任选地，其中所述生物样品是选自血液、全血或血浆的生物样品；任选地，所述生物样品是包含循环游离DNA(circulating cell
‑
free DNA，cfDNA)的样品。3.引物对，其包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物用于检测CGI_CORO6的甲基化状态；任选地，所述正向引物包含5
’‑
GGGAGATTAGAATTTTTGGAGTTTAGG
‑3’
，所述反向引物包含5
’‑
CGAAACTCGCAATCCAACCTC
‑3’
。4.组合物或试剂盒，其包含根据权利要求3所述的引物对。5.根据权利要求4所述的组合物或试剂盒，其还包含探针；任选地，所述探针的序列包含5
’‑
AGATTTACGTCGTTTTAGCG
‑3’
。6.根据权利要求5所述的组合物或试剂盒，其中所述探针是经标记的；任选地，所述探针是经荧光标记的；进一步任选地，所述探针是由选自FAM、VIC和MGB的荧光团标记；又进一步任选地，所述探针包含5
’‑
FAM
‑
AGATTTACGTCGTTTTAGCG
‑
MGB
‑3’
；任选地，所述试剂盒包含扩增DNA所需的一种或多种试剂，所述试剂选自扩增缓冲液、dNTP和扩增DNA所需的酶。7.检测生物样品的CGI_CORO6甲基化水平的方法，包括：A)从个体中获取生物样品；B)将所述生物样品中的非甲基化CpG转化为TpG，然后用引物对与探针进行扩增；其中所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物用于检测CGI_CORO6的甲基化水平；任选地，所述正向引物包含5
’‑
GGGAGATTAGAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋雷，文路，汤富酬，王继征，任杰，姜琳，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：