一种获得识别空间构象表位抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种获得识别空间构象表位抗体的方法，其包括如下步骤：构建重组质粒；所述重组质粒表达抗原蛋白和表面锚定蛋白形成的融合蛋白；将重组质粒转入真核细胞，获得重组真核细胞；重组真核细胞表面展示抗原蛋白或抗原蛋白片段；采用重组真核细胞免疫动物，获得杂交瘤细胞；从杂交瘤细胞中分离抗体；该抗体即为识别抗原蛋白空间构象表位的抗体。采用该方法获得的识别CCN1蛋白空间构象表位的抗体—单克隆抗体15G7，其仅结合天然CCN1蛋白，不结合变性CCN1蛋白，即只能专一性的识别天然构象的CCN1蛋白。本发明专利技术可以获得识别空间构象表位抗体，具有重要的应用价值。具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种获得识别空间构象表位抗体的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种获得识别空间构象表位抗体的方法。

技术介绍

[0002]治疗性抗体已被证明是对抗人类疾病的强大工具。迄今为止，市场上大多数治疗性抗体都是通过杂交瘤和噬菌体展示方法开发的。然而，通过这些方法产生的高亲和力抗体依旧充满挑战。由于蛋白抗原本身的特性，采用上述方法获得的抗体可能随机识别并结合到抗原不同结构区域(抗体结合表位)。抗体在体内的生物学活性各异。例如抗CD20抗体依照抗体结合表位分为I型抗体(如美罗华单抗)和II型抗体(如奥比妥珠单抗)，II型抗体引发的补体杀伤作用较I型抗体显著降低但具有更强的抗体依赖的细胞杀伤能力、以及I型抗体所不具有的对靶细胞直接杀伤的能力。在非霍奇金式淋巴瘤的临床数据对比中，与美罗华单抗相比，奥比妥珠单抗显著延长了病人的无进展生存期。又如，抗CD22抗体M971和Epratuzumab由于结合表位的不同，仅后者可以引发CD22分子的迅速内化。综上所述，在抗体筛选过程中，保证所构建抗体筛选文库的多样性是获得具有生物学活性抗体的重要前提。抗原自身的性质决定了从上述方法获得抗体的结合表位的偏好性。抗体结合表位可以是由连续排列的氨基酸所构成的短肽(线性表位)，也可以是由不连续排列的氨基酸所形成的复杂空间构象(空间表位)。抗原上被抗体所结合的线性表位，例如多肽，主要被T淋巴细胞的组织相容性复合体(MHC)所识别，而抗原上不连续的空间构象表位主要被B细胞识别。
[0003]产生针对构象表位的抗体是具有挑战性的，因为抗原的空间构象结构必须在动物免疫和体外抗体筛选中得到很好维持。抗原空间构象不稳定性导致候选药物筛选的不一致和不可再现性。一般而言，为了方便蛋白抗原的纯化，需要在抗原表达时预先将纯化标签(如his标签、免疫球蛋白Fc部分)与抗原融合，但这种策略有如下局限性：(1)蛋白质标签的引入可能会破坏抗原的空间结构；(2)这些标签在动物免疫中具有免疫原性，需要引入额外的抗体筛选步骤；(3)为了高效收获抗原并在纯化过程中维持其空间构象，通常需要常规纯化程序进行优化，这样的优化工作是繁琐且费力的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是获得识别抗原蛋白空间构象表位抗体。
[0005]本专利技术首先保护一种获得识别抗原蛋白空间构象表位抗体的方法，可包括如下步骤：
[0006](1)构建重组质粒；所述重组质粒表达抗原蛋白和表面锚定蛋白形成的融合蛋白；
[0007](2)将步骤(1)构建的重组质粒转入真核细胞，筛选，获得重组真核细胞；
[0008]所述重组真核细胞表面展示抗原蛋白或抗原蛋白片段；
[0009](3)采用步骤(2)获得的重组真核细胞免疫动物，获得杂交瘤细胞；
[0010](4)从步骤(3)获得的杂交瘤细胞中分离抗体；该抗体即为识别抗原蛋白空间构象表位的抗体。
[0011]所述步骤(1)中，表面锚定蛋白可为糖磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)。
[0012]所述步骤(1)中，所述抗原蛋白可为CCN1蛋白(蛋白ID为NP_001545.2)。
[0013]所述步骤(1)中，所述重组质粒中含有二氢叶酸还原酶抗性基因。
[0014]所述步骤(1)中，所述重组质粒可为SEQ ID NO:1所示的融合序列和pOptiVEC
‑
TOPO载体使用TA克隆法连接而成。SEQ ID NO:1中，自5
’
末端起，第1
‑
6位为Kozak序列，第7
‑
1149位为编码人CCN1蛋白的DNA，第1150
‑
1296位为编码GPI的DNA。
[0015]所述步骤(2)中，真核细胞可为Sp2/0
‑
Ag14细胞。Sp2/0
‑
Ag14细胞即野生型Sp2/0
‑
Ag14细胞(ATCC公司的产品，产品目录号为CRL
‑
1581)。
[0016]所述步骤(2)中，所述筛选可为甲氨蝶呤筛选。
[0017]上述方法中，当抗原蛋白为CCN1蛋白时，所述识别CCN1蛋白空间构象表位的抗体具体可为单克隆抗体15G7。所述单克隆抗体15G7具体由重链和轻链组成。所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。所述单克隆抗体15G7结合CCN1蛋白。
[0018]采用上述任一所述的方法获得的识别抗原蛋白空间构象表位抗体在筛选药物中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0019]上述应用中，所述识别抗原蛋白空间构象表位抗体可为所述单克隆抗体15G7。
[0020]本专利技术还保护一种单克隆抗体15G7，具体由重链和轻链组成。所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。所述单克隆抗体15G7结合CCN1蛋白。
[0021]本专利技术还保护编码所述单克隆抗体15G7的核酸分子。所述编码所述单克隆抗体15G7的核酸分子可由编码所述重链的核酸分子和编码所述轻链的核酸分子组成。所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0022]本专利技术通过对真核细胞的工程化改造，将抗原蛋白或抗原蛋白片段展示在真核细胞表面，之后采用真核细胞免疫动物，获得杂交瘤细胞；从杂交瘤细胞中分离抗体；该抗体即为识别抗原蛋白空间构象表位的抗体。采用该方法获得的识别CCN1蛋白空间构象表位的抗体—单克隆抗体15G7，其仅结合天然CCN1蛋白，不结合变性CCN1蛋白，即只能专一性的识别天然构象的CCN1蛋白。与传统方法相比，本专利技术提供的方法不仅无需抗原纯化步骤，而且制备获得的抗体为识别空间构象表位的抗体。本专利技术具有重要的应用价值。
附图说明
[0023]图1为实施例1中步骤三的检测结果。
[0024]图2为实施例2的检测结果。
[0025]图3为实施例3的检测结果。
[0026]图4为实施例4的检测结果。
具体实施方式
[0027]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐
明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。
[0028]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029]CCN1蛋白(蛋白ID为NP_001545.2)属于早期响应基因编码的产物之一，其表达受到诸多病理和生理环境的调控，如细胞因子、机械拉伸、有害毒素等。CCN1具有四个结构域，分别为胰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种获得识别抗原蛋白空间构象表位抗体的方法，包括如下步骤：(1)构建重组质粒；所述重组质粒表达抗原蛋白和表面锚定蛋白形成的融合蛋白；(2)将步骤(1)构建的重组质粒转入真核细胞，筛选，获得重组真核细胞；所述重组真核细胞表面展示抗原蛋白或抗原蛋白片段；(3)采用步骤(2)获得的重组真核细胞免疫动物，获得杂交瘤细胞；(4)从步骤(3)获得的杂交瘤细胞中分离抗体；该抗体即为识别抗原蛋白空间构象表位的抗体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，表面锚定蛋白为糖磷脂酰肌醇。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，真核细胞为Sp2/0
‑
Ag14细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述抗原蛋白为CCN1蛋白。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述重组质粒为SEQ ID NO:1所示的融合序列和pOptiVEC
‑
TOPO载体使用TA克隆法连接而成...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋南，林坜桁，
申请(专利权)人：杏联药业苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：