β-半乳糖苷酶突变体及其在制备长链GOS中的应用制造技术

本发明专利技术公开了β

【技术实现步骤摘要】
β
‑
半乳糖苷酶突变体及其在制备长链GOS中的应用


[0001]本专利技术涉及β
‑
半乳糖苷酶突变体及其在制备长链GOS中的应用，属于酶工程


技术介绍

[0002]随着社会的进步，现在人们的生活水平越来越高，人们越发注重身体保健，因此，社会上要求发展功能性食品的呼声越来越强烈。低聚半乳糖(GOS)便是功能性食品中一种具有天然属性的功能性低聚糖。GOS通常情况下是以D
‑
葡萄糖为还原端残基，再连接2
‑
8个半乳糖的长链多糖，某些情况下它的还原端也可为半乳糖。由于GOS在高温以及低pH下均表现出较高的稳定性，让它特别适合在商业食品中应用，并且为了模拟母乳中的人乳寡糖(HMOs)的作用，GOS是目前商业婴儿奶粉中首选的益生元添加剂。
[0003]GOS可以通过多种方式获得，目前市场上最主要的生产方式是由乳糖通过β
‑
半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)制备获得。β
‑
半乳糖苷酶，全称为β
‑
D
‑
半乳糖苷半乳糖水解酶，是一种对乳糖既可以发生水解也可以进行转糖苷的酶，在食品加工工业中有着广泛的应用。β
‑
半乳糖苷酶与大多数糖苷水解酶(GHs)一样，通过双置换催化机制来将底物乳糖水解或形成GOS，该机制包含两个过程：糖基化与去糖基化，会形成一个中间体酶
‑
糖基复合物。在去糖基化过程中，如果受体为水即为水解反应，生成半乳糖；如果受体为糖即为转苷反应，生成GOS，二者互为竞争关系。
[0004]有文献指出，在体外实验中，一些婴儿肠道菌群体外分离株会优先分解聚合度为3
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8的GOS。这说明在一定聚合度范围内(2
‑
8)，更高聚合度的GOS对肠道发酵更有耐受力，从而在更远的肠道位点发挥益生作用。目前，通过蛋白质工程手段对现有的酶进行改造从而获得满足需求的突变体是常用的手段之一。

技术实现思路

[0005]针对于目前存在的问题，本专利技术通过对来源于Bacillus circulans的β
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半乳糖苷酶进行突变，从中筛选到了两株能够显著提升转苷反应比率的突变体。
[0006]本专利技术首先提供了β
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半乳糖苷酶突变体，所述突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β
‑
半乳糖苷酶的第333位或467位发生取代。
[0007]在一种实施方式中，将第333位的精氨酸取代成甲硫氨酸，或是将第467位的天冬酰胺取代成丝氨酸。
[0008]本专利技术还提供了一种编码上述β
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半乳糖苷酶突变体的基因。
[0009]本专利技术还提供了携带所述基因的载体。
[0010]在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pPIC9K、pPIC3K、pET系列载体、Duet系列、pGEX系列。
[0011]本专利技术还提供了携带所述基因或者所述载体的微生物细胞。
[0012]在一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于细菌、真菌细胞。
[0013]在一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、毕赤酵母或枯草芽孢杆菌。
[0014]本专利技术还提供了一种制备低聚半乳糖的方法，所述方法为将所述β
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半乳糖苷酶突变体添加至含有乳糖的反应体系中进行反应，生成低聚半乳糖。
[0015]在一种实施方式中，所述β
‑
半乳糖苷酶突变体的添加量不低于0.2U/g乳糖。
[0016]在一种实施方式中，底物乳糖的浓度为300～400g/L，优选为400g/L。
[0017]在一种实施方式中，所述反应体系中，pH为5.0
±
0.1。
[0018]在一种实施方式中，所述反应体系中，温度为45～55℃，优选为50℃。
[0019]在一种实施方式中，所述反应体系中，反应的时间为12～20h。
[0020]在一种实施方式中，所述反应的时间为14h。
[0021]本专利技术还提供了所述突变体或所述基因或所述微生物细胞在制备低聚半乳糖及其衍生物中的应用。
[0022][有益效果][0023]本专利技术通过对野生型β
‑
半乳糖苷酶的第333位和467位发生突变，获得了两株转苷能力显著提升的突变体，突变体在制备低聚半乳糖长链多糖(链长≥3)的产率上较野生型有了明显的提高，而在GOS中，链长越长所具有的益生效果越好。野生型制备低聚半乳糖长链多糖产率为33.47％，突变体R333M、N467S的产率分别为41.06％、44.16％，较野生型分别提高了24.29％、33.55％，提升了低聚半乳糖的益生效果。
附图说明
[0024]图1为野生型和突变体β
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半乳糖苷酶的纯化蛋白SDS
‑
PAGE电泳图；其中，M为蛋白分子量标准；1，野生型WT；2，突变体R333M；3，突变体N467S。
[0025]图2为β
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半乳糖苷酶制备长链低聚半乳糖示意图。
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步的阐述。
[0027]下述实施例中涉及的邻硝基苯基β
‑
D
‑
半乳糖苷(oNPG)、乳糖购自国药化学试剂有限公司。
[0028]下述实施例中涉及的培养基如下：
[0029]LB液体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
[0030]LB固体培养基：在LB液体培养基基础上，添加琼脂：20g/L。
[0031]TB培养基：酵母粉24g/L，甘油5g/L，胰蛋白胨12g/L，K2HPO4·
3H2O 16.43g/L，KH2PO
4 2.31g/L。
[0032]下述实施例中涉及的检测方法如下：
[0033]β
‑
半乳糖苷酶酶活力的测定：
[0034]反应体系为3mL，pH 5.0的磷酸缓冲液1.8mL，加入适度稀释(以反应终止时反应液420nm吸光值在0.2
‑
1.2范围为宜)的粗酶液100μL，再加入100μL 20mmol/L的oNPG，在50℃恒温水浴中反应10min，10min后立即加入1mL的1mol/L的Na2CO3溶液终止反应，冰浴5min，于420nm处测光吸收值。以加热失活的酶液按照同样的方法处理作空白。
[0035]酶活单位定义：每毫升酶液每分钟水解oNPG产生1μmol的邻硝基苯酚的酶活力为一个酶活单位。
[0036]相对酶活计算方法：酶活＝(0.223*A
420
+0.00007)*反应体系*稀释倍数/(反应时间*加酶量)
[0037]低聚半乳糖含量的检测方法：
[0038]低聚半乳糖长链多糖为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.β
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半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β
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半乳糖苷酶的第333位或467位发生取代。2.根据权利要求1所述的β
‑
半乳糖苷酶突变体，其特征在于，将第333位的精氨酸取代成甲硫氨酸，或是将第467位的天冬酰胺取代成丝氨酸。3.编码权利要求1或2所述β
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半乳糖苷酶突变体的基因。4.携带权利要求3所述基因的载体。5.携带权利要求3所述基因或权利要求4所述载体的微生物细胞。6.根据权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞包括但不限于大...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏伟，吴敬，许俊勇，黄燕，陈晟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：