一种检测羊副结核分枝杆菌的ELISA试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于羊养殖技术领域，具体涉及一种检测羊副结核分枝杆菌的ELISA试剂盒及其应用。所述ELISA试剂盒包括混合包被抗原，所述混合包被抗原包括氨基酸序列如SequenceNO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原，按照ELISA方法进行检测，若检测结果为阳性时，则待检测样品携带羊副结核分枝杆菌。该ELISA试剂盒及检测方法适用于6月龄左右的羊进行羊副结核分枝杆菌，而且对处于亚临床阶段的MAP感染检测灵敏度高于IDVET副结核间接检测试剂盒。间接检测试剂盒。间接检测试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一种检测羊副结核分枝杆菌的ELISA试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于羊养殖
，具体涉及一种检测羊副结核分枝杆菌的ELISA试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]副结核病是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis，MAP，又称禽分枝杆菌副结核亚种)引起的反刍动物慢性肠道传染病，以顽固性腹泻、渐进性消瘦和肠黏膜增厚形成皱襞、慢性肉芽肿性肠炎为特征，被OIE列为B类疫病，被我国列为Ⅱ类传染病。我国每年从国外进口大量种羊，尽管实施副结核病国外预检制度，但从多批种羊中均检出该病。
[0003]羊通常在幼年期经口感染MAP，经历12个月以上的亚临床期后部分患羊出现持续性腹泻，病情严重的羊会死亡。在这个极长的亚临床阶段，病原菌随感染动物粪便不断或间歇性地排出，出现临床症状时排菌量明显增加，成为传染源。大多数感染羊呈隐性感染或慢性感染，表现为渐进性消瘦、不耐运动、排软性粪便，其中部分患羊因极度瘦弱、生长缓慢只能作淘汰处理，造成养殖投入的浪费和经济损失。副结核病没有有效的预防和治疗方法，实施监测、隔离、淘汰等综合防治措施是防控该病的主要方法。
[0004]目前，用于副结核病诊断的产品有检测MAP抗体的间接ELISA检测试剂盒。该产品使用MAP提取物作为包被抗原，同时产品依赖于进口。MAP与其他常见的分枝杆菌有共同抗原，需要繁琐的预吸收步骤来去除提取物中的共同抗原，以确保试剂盒的特异性。但预吸附降低了试剂盒检测和诊断敏感性，导致处于亚临床期的MAP感染动物阳性检出率降低。需要更敏感、高通量的筛选分析来识别在MAP感染亚临床早期阶段的动物。
[0005]自从第一个完整的MAP基因组序列发表以来，许多MAP蛋白被研究，以确定潜在候选抗原，用于鉴别轻度或早期MAP感染的动物。这些研究筛选出一些在牛源MAP感染期间具有免疫原性的候选抗原。MAP主要有牛型和羊型2个亚型，牛型菌株易感动物较多，毒力较强；羊型菌株对羊以外的其他宿主的致病性较弱。牛型和羊型MAP有一定的抗原差异，Souriau等(2017)从Mon等(2012)研究的牛型MAP的54抗原中选择16个抗原用于羊副结核分枝杆菌病的诊断，发现只有3个抗原能作为诊断用候选抗原。目前在感染羊只副结核分枝杆菌的抗体应答方面的认识不系统，在羊副结核病有诊断价值的抗原筛选上，应该明确哪些抗原在数月龄羊体内产生抗体应答，以提高羊副结核病早期感染和潜伏期感染的检测敏感性。基于本专利技术的对比研究结果显示，此3个抗原不适用于数月龄羊体内的抗体应答。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术在于提供一种检测羊副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis)的ELISA试剂盒及ELISA检测方法，该ELISA试剂盒适用于检测6月龄左右的羊是否携带羊副结核分枝杆菌，而且检准率高。
[0007]所述ELISA试剂盒包括混合包被抗原，所述混合包被抗原包括氨基酸序列如
Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原。
[0008]具体地，本专利技术利用有临床症状的6月龄绵羊副结核病阳性血清对已报道的45个重组蛋白抗原进行筛选，筛选到16个重组蛋白与绵羊副结核病阳性血清有反应的抗原，表明这16个抗原在早期阶段有抗体应答。分别用以这16个重组蛋白作为包被抗原制备的间接ELISA方法，检测疫区有副结核病典型病理学特征的绵羊羊群，筛选出4个对绵羊副结核病MAP抗体有高检出率的重组蛋白。以这4个重组蛋白为包被抗原制备的绵羊间接ELISA方法,其检测结果与有严重腹泻的临床症状符合率较高，表明这4个抗原有高诊断价值。结合检测绵羊粪便中针对MAP核酸的PCR结果，以此4个抗原作为混合包被抗原的ELISA试剂盒，除了对严重腹泻绵羊副结核病有高检出率，还对处于亚临床症状的绵羊副结核病有较高检出率。
[0009]优选地，所述ELISA试剂盒的检测样品为羊血清，更优选为5
‑
7月龄羊血清，更优先为5
‑
7月龄绵羊血清。
[0010]具体地，所述ELISA试剂盒的使用方法是将Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原分别稀释成一定浓度后进行混合，优选为等体积混合。
[0011]进一步，所述检测羊副结核分枝杆菌的ELISA试剂盒还包括ELISA试剂盒常规的试剂或装置，如孔板、加热器、封闭液、PBST洗涤液、稀释液、酶标二抗、显色液、酶标仪等。
[0012]优选地，所述酶标二抗为HRP标记的兔抗绵羊IgG抗体，所述显色液为四甲基联苯胺。
[0013]本专利技术还提供一种检测羊副结核分枝杆菌的ELISA方法，所述ELISA方法包括：使用混合抗原作为包被抗原进行检测；所述混合抗原包括氨基酸序列如Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原；当检测的结果为阳性时，则待检测样品携带羊副结核分枝杆菌。
[0014]进一步，所述混合抗原作为包被抗原时，将4种抗原进行混合，所述4种抗原的浓度均为7.5
‑
8.5μg/mL，优选浓度为8μg/mL，更优选为浓度为8μg/mL的4种抗原等体积混合。
[0015]进一步，所述检测样品可以是羊血清或者羊粪便或者其他携带羊副结核分枝杆菌的样品。
[0016]优选地，所述待检测样品为羊血清。
[0017]更优选为，所述待检测样品为绵羊血清。
[0018]更优选地，所述待检测样品为5
‑
7月龄羊血清，更优选为6月龄羊血清。
[0019]更优选地，所述待检测样品为5
‑
7月龄绵羊血清，更优先为6月龄绵羊血清。
[0020]进一步，所述羊血清为1:80
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120稀释的羊血清。优选为1:100稀释的羊血清为待检测样品。其中所述羊血清包含5
‑
7月龄羊血清或5
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7月龄绵羊血清或绵羊血清。优选为6月龄羊血清。
[0021]在某些具体实施例中，所述检测羊副结核分枝杆菌的ELISA方法包括：
[0022](1)将Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3、Sequence NO：4所示的抗原等体积混合做为包被蛋白包被96孔板，4℃包被过夜；
[0023](2)用2％明胶封闭液于37℃封闭2h；
[0024](3)加入待检测羊血清1:100稀释，37℃反应30min；
[0025](4)用PBST洗涤3次，加入稀释的HRP标记的兔抗绵羊IgG抗体，37℃反应60min；
[0026](5)使用四甲基联苯胺显色10min，用酶标仪测定OD450n本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测羊副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis)的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒包括混合包被抗原，所述混合包被抗原包括氨基酸序列如Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原。2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，ELISA试剂盒的检测样品为5
‑
7月龄羊血清。3.一种检测羊副结核分枝杆菌的ELISA方法，其特征在于，所述ELISA方法包括：使用混合抗原作为包被抗原进行检测；所述混合抗原包括氨基酸序列如Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原。4.根据权利要求3所述的ELISA方法，其特征在于，所述混合抗原作为包被抗原时，将4种抗原进行混合，所述4种抗原的浓度均为7.5
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【专利技术属性】
技术研发人员：付利芝，沈克飞，张素辉，徐登峰，李鑫，吉雅图，郑华，许国洋，余远迪，李波，
申请(专利权)人：乌拉特后旗动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：