一种小肽在制备治疗骨关节炎药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种小肽在制备环氧化酶

【技术实现步骤摘要】
一种小肽在制备治疗骨关节炎药物中的应用


[0001]本专利技术属于制药领域，具体涉及一种小肽在治疗骨关节炎中的应用。

技术介绍

[0002]骨关节炎是一种慢性退行性疾病，包括关节软骨丧失、软骨下骨硬化、骨赘和低度滑膜炎、半月板及髌骨下脂肪垫损伤。严重者可发生关节畸形，行动障碍。现代医学多采用消炎镇痛药进行治疗，如非甾体抗炎药和弱阿片类药物。然而，由于这些药物只能缓解不同症状的疼痛，但不能有效阻止关节软骨退变，长期用药治疗不利于远期身体健康，非甾体抗炎药存在潜在的心血管和消化道出血风险，加之患者抗拒药物治疗，从而导致疗效不佳，严重影响人们日常正常活动需求。为此，亟需探索预防、延缓甚至逆转骨关节炎的发病，寻找安全有效的保护剂或者天然制剂。
[0003]龟板是我国一种传统中药，具有滋阴潜阳、强肝肾、抗癌、防癌，对阴虚潮热、骨蒸劳热、心烦意乱、高血压、脑中风等症具有较好的预防和治疗作用。有研究表明一些龟提取物具有良好抗高血压和抗菌作用。从石金钱龟中提取的蛋白质和肽已在动物实验中被证明具有抗氧化和免疫系统增强作用。然而，龟板肽对于抗炎及其作用机制研究较少，对于骨关节炎是否存在影响尚不清楚。但有研究发现，龟甲胶能延缓关节软骨细胞的退变，延缓骨关节炎的病理进程。还有研究发现，龟板肽分子是治疗骨病的有效成分，能够治疗骨质疏松。但龟板肽是否对关节炎有效仍未被证实。
[0004]本专利技术通过提取龟板肽，然后对龟板肽中的肽段组成和功能进行大量分析和验证，最终得到一种对骨关节炎具有较好治疗作用的小肽。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种小肽在制备治疗骨关节炎药物中的用途。
[0006]上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0007]申请人首先从中药龟板中提取分离生物活性肽，接着通过液质联用、质谱解析、序列比对、分子对接和体外酶活抑制实验等大量试验从中筛选出具有较强COX
‑
2酶抑制活性的小肽，其氨基酸序列为N
‑
Q
‑
G
‑
X
‑
B(SEQ ID No.1)或K
‑
N
‑
G
‑
P(SEQ ID No.2)或W
‑
G
‑
X
‑
B(SEQ ID No.3)。该小肽为首次从中药龟板中分离鉴定，为充分利用龟板药材提供了新途径，同时也为相关药物的开发提供了新资源。
[0008]上述小肽既可以从龟板中提取分离，也能使用本领域所熟知的人工方法合成。当使用提取分离方法进行制备时，需要从提取得到的多肽中分离目标肽段，所述目标肽段的分离可使用本领域所熟知的色谱法等，例如使用半制备或制备液相色谱进行分离，在已明确目标肽段分子结构的基础上，本领域技术人员在使用这些分离方法时无需克服技术障碍。
[0009]当使用人工合成方法进行制备时，该小肽由于分子量小，因此还具有合成工艺简单、周期短、成本低廉等优势。
[0010]体内动物实验结果表明：本专利技术提供的小肽对大鼠体重没有显著影响，说明小肽不会对大鼠正常生长造成损害。但是该小肽能明显改善膝关节软骨缺损及表面状态，说明对骨关节损伤具有治疗作用；通过对血清中CTX
‑Ⅱ
、COMP和关节液TNF
‑
α含量分析，发现该小肽能缓解骨关节炎症状，延缓关节软骨的降解和退变，且作用温和，副作用小。
[0011]综上，本专利技术提供的小肽既能在体外发挥对COX
‑
2酶的抑制活性，又能在体内发挥对骨关节炎的治疗作用，从而能应用于制备COX
‑
2抑制剂或治疗骨关节炎药物，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0012]图1：小肽对大鼠体重变化趋势的影响。
[0013]图2：小肽对大鼠血清中CTX
‑Ⅱ
含量的影响。
[0014]图3：小肽对大鼠血清中COMP含量的影响。
[0015]图4：小肽对大鼠关节液TNF
‑
α含量的影响。
具体实施方式
[0016]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。
[0017]实施例1多肽的制备
[0018]通过煎煮、萃取、浓缩、过滤等手段将龟板中的总蛋白提取出来，并减少提取物中脂溶性和其它小分子水溶性成分如矿物质等含量，接着将总蛋白进行酶解得到多肽，具体方法如下：
[0019]1.总蛋白的提取
[0020](1)在热水中处死石金钱龟，剔除内脏、血液及鳞片后，将龟板洗净并打碎；
[0021](2)在4％醋酸中浸泡碎龟板1小时后洗净放入锅中熬煮3次，每次煮制3小时；
[0022](3)将3次熬煮得到的汤汁合并、过滤，在55℃下旋转蒸发浓缩至基本无冷凝液流出；
[0023](4)将浓缩物用石油醚萃取三次除去脂溶性杂质，接着用透析袋过滤除去部分水溶性小分子；
[0024](5)放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥，粉碎后按6％添加量加入到0.6moL/L的EDTA溶液中，搅拌反应30min以脱去蛋白中结合的钙，过滤，滤液再次冷冻干燥，得蛋白粗提取物。
[0025]2.多肽的制备
[0026](1)称取蛋白粗提取物，以1:25(g/mL)的固液比添加pH 7.5的NaOH溶液；
[0027](2)加入碱性蛋白酶，使溶液中的酶浓度为1.2％，55℃恒温条件下水浴酶解6h；
[0028](3)再放入95℃热水浴中，持续搅拌15分钟使酶灭活；
[0029](4)4℃，10000r/min离心10分钟，收集离心液；
[0030](5)将离心液通过截留分子量小于6000D的超滤膜过滤，除去灭活酶和未水解的大分子蛋白，然后旋转蒸发浓缩后放入真空冷冻干燥箱冻干，粉碎后得到多肽粉末。
[0031]实施例2肽段的鉴定和功能验证
[0032](1)龟板肽的主要肽段鉴定
[0033]采用高效液相色谱
‑
电喷雾质谱
‑
质谱联用仪(HPLC
–
ESI
‑
QqTOF
–
MS/MS)对实施例1制备的龟板肽进行分析，肽溶液在Inter Sustain AQ
‑
C18(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱上以0.8mL/min的流速分离；流动相：乙腈+0.1％三氟乙酸(B相)，水+0.1％三氟乙酸(A相)，浓度10mg/mL，进样量8μL，柱温30℃，检测波长215nm。梯度洗脱条件：0～9min，0％～9％B；9～12min，9％～13％B；12～20min，13％～26％B；20～60min，26％～70％B。
[0034]质谱条件为：ESI+离子源；雾化器压力为40.00psi；毛细管电压，3500v；干气流量，10.0L/min；干气温度325℃；m/z 100～1500扫描光谱。质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小肽在制备环氧化酶
‑
2(COX
‑
2)抑制剂中的用途，其特征在于：所述小肽来源于龟板，其氨基酸序列为N
‑
Q
‑
G
‑
X
‑
B、K
‑
N
‑
G
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：张久亮，贺芳霞，唐翠娥，闫佳兴，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：