一种慢性萎缩性胃炎病变的模拟方法及小鼠造模鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种慢性萎缩性胃炎病变的模拟方法，包括步骤：（1）采用化生的病变阶段作为模拟对象；（2）采用解痉多肽表达化生的模拟形式；（3）对胃黏膜壁细胞条件性敲除GRIM

【技术实现步骤摘要】
一种慢性萎缩性胃炎病变的模拟方法及小鼠造模鉴定方法


[0001]本专利技术属于生命科学领域，具体涉及慢性萎缩性胃炎病变的模拟方法。

技术介绍

[0002]胃癌是我国高发消化道恶性肿瘤，其中肠型胃癌是最常见胃癌亚型，严重威胁人类健康。慢性萎缩性胃炎(Chronic Atrophic Gastritis,CAG)作为公认的肠型胃癌癌前病变，关于胃癌的形成有多种学说，1975年Correa提出了一个渐进演变模式:正常胃黏膜
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慢性浅表性胃炎
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慢性萎缩性胃炎(Chronic Atrophic Gastritis,CAG)
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肠上皮化生
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不典型增生
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胃癌,众多基因及分子改变的累积与这一演变过程密切相关。CAG是胃癌的癌前期疾病,尤其是伴有肠上皮化生及不典型增生这些胃癌癌前病变(Precancerous Lesions of Gastric Cancer,PLGC)的CAG与胃癌的发病高度相关,所以如果能够有效逆转CAG与PLGC,可以大幅度降低胃癌的发病率。
[0003]在现代实验研究中,实验动物被广泛用来复制人类疾病模型,从而研究疾病的发生、发展机制和治疗方法等。他是实验医学的重要基础。只有选择公认的实验动物模型其实验结果才有一定的可信度,故对实验动物模拟疾病的相似性等有较高的要求。如何成功复制理想的CAG实验动物模型,对研究CAG的预防、发病机制以及逆转治疗具有至关重要的作用。现已有研究构建了多种CAG模型：
[0004]化学造模法：利用化学试剂模仿高危因素对大鼠进行干预，选用的化学因素有N
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甲基
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N'
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硝基
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N
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亚硝基胍、氨水、去氧胆酸钠、抑酸剂、非甾体抗炎药、乙醇等。以上因素造成反复的慢性损伤及炎症刺激致使胃固有腺体被破坏而发生萎缩。
[0005]手术造模法：常用的有胃空肠吻合术及弹簧幽门植入术。手术造模法成模时间短，但常常受术式影响，模拟的胆汁反流量无法确定,所造成大鼠黏膜损伤的不一致，常常同时段浅表与萎缩模型混杂。且术后感染的高发，使得动物死亡率较高。
[0006]生化、免疫法：慢性萎缩性胃窦炎的发病与局部免疫活化有关系。戴关海等用同种大鼠的胃黏膜，生理盐水匀浆液，与完全福氏佐剂以1:1比例配成乳剂，对大鼠皮下注射，联合去氧胆酸钠、乙醇刺激，成功复制慢性萎缩性胃炎模型。H.pylori感染为CAG致病因素之一。Lee等从临床分离出H.pylori菌株SS1,此菌株能长期有效的定植在实验动物胃中,并成功的在实验动物胃中产生慢性炎症,黏膜萎缩,肠上皮化生及不典型增生等病理变化。
[0007]综合造模法：单因素模型造模时间长，模型稳定性差，多因素联合造模法可提高模型成型率，缩短成模时间。且慢性萎缩性胃炎病因复杂，故实验中常采用联合多种因素的综合造模法，模拟人类不健康生活习惯，使胃黏膜损伤和修复反复进行，更贴近临床发病机制。魏玥等用MNNG溶液灌胃，配合自由饮用0.1％氨水溶液及进食含0.03％雷尼替丁的颗粒状饲料，3种因素联合建立CAG伴Dys大鼠模型。
[0008]病症结合模型：CAG病症结合模型实际上是在单纯CAG疾病模型的基础上,复合中医证候模型。陈小野等采用主动免疫加脱氧胆酸钠和阿司匹林水溶液交替饮用法进行疾病造模,在CAG造模基础上进行脾虚证、肝郁证和肾虚证复合造模。徐珊等复制大鼠肝郁证、脾
虚证、湿热证的CAG病证结合模型，在CAG模型复制的同时,脾虚CAG组第7周开始采用苦寒泻下(每日灌胃生大黄煎剂)加饥饱失常法(采取单日禁食,双日足量喂食)建立脾虚证候模型。
[0009]虽然，CAG造模多有研究，但是仍然存在诸多问题。比如DMP
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777、L635干预方法，干预试剂价格昂贵而难以获得；他莫昔芬造模不仅胃黏膜缺乏炎症且在3week后可自行恢复，不能稳定成模；Hp作为WHO定义的I类致癌因子，是CAG乃至胃癌形成最常见的诱导因素，但其作用分子靶点尚不明确，且模型在造模周期、途径及生物安全等方面均具有一定的局限性。

技术实现思路

[0010]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种模拟度高、稳定持久、具有特定表型的、高效的慢性萎缩性胃炎病变的模拟方法。
[0011]慢性萎缩性胃炎病变的模拟方法，包括步骤：
[0012](1)采用化生的病变阶段作为模拟对象；
[0013](2)采用解痉多肽表达化生的模拟形式；
[0014](3)对胃黏膜壁细胞条件性敲除GRIM
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19基因。
[0015]本专利技术的模拟方法所获得的模型在8个月龄胃黏膜发生自发性解痉多肽表达化生(Spasmolytic Polypeptide Expressing Metaplasia,SPEM)病变，且能够稳定表达特定表型，不会反复。
[0016]进一步的，上述模拟方法包括首次将GRIM
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19flox基因编辑小鼠GRIM
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19
flox/flox
与ATP4b
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Cre基因编辑小鼠杂交，获得胃黏膜特异性壁细胞GRIM
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19敲除小鼠品系(GRIM
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19
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/
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/ATP4b
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Cre，SPF级)。
[0017]具体的，所述胃黏膜特异性壁细胞GRIM
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19敲除小鼠品系的构建方法，包括以下步骤：
[0018](1)确定目的基因：小鼠GRIM
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19(GenBank accession number:NM_023312.2:,Ensembl:ENSMUSG00000036199)位于小鼠第8号染色体，确定了5个外显子(自外显子2中ATG起始密码子至外显子5中TAG终止密码子)，选择外显子3作为条件性敲除区域。外显子3的删除将导致GRIM
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19基因功能的缺失。
[0019](2)设计与构建打靶载体质粒：使用来自C57BL/6J文库的BAC克隆RP23
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74A9或RP23
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114L20作为模板，通过PCR产生同源臂和CKO区域。在打靶载体中，Neo盒的侧翼为Frt位点，CKO区域的侧翼为LoxP位点。DTA将用于阴性选择。
[0020](3)ES细胞电转和阳性克隆筛选后，进行ES显微注射和制备嵌合体，嵌合体小鼠与flp小鼠杂交，敲除NEO抗性基因，获得GRIM
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19
flox/
‑
F1小鼠。繁殖获得后代小鼠并鉴定，与野生型小鼠C57B/L6合笼繁殖传代。获得GRIM
‑
19
flox/flox
纯合小鼠。
[0021](4)将GRIM
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种慢性萎缩性胃炎病变的模拟方法，包括步骤：（1）采用化生的病变阶段作为模拟对象；（2）采用解痉多肽表达化生的模拟形式；（3）对胃黏膜壁细胞条件性敲除GRIM
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19基因。2.如权利要求1所述的慢性萎缩性胃炎病变的模拟方法，包括将GRIM
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19 flox基因编辑小鼠GRIM
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19 flox/flox
与ATP4b
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Cre基因编辑小鼠杂交，获得胃黏膜特异性壁细胞GRIM
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19敲除小鼠品系（GRIM
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19 ‑
/
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/ATP4b
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Cre，SPF级）。3.如权利要求2所述的慢性萎缩性胃炎病变的模拟方法，所述GRIM
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19敲除小鼠品系的构建方法包括以下步骤：（1）确定目的基因：小鼠GRIM
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19位于小鼠第8号染色体，确定了5个外显子（自外显子2中ATG起始密码子至外显子5中TAG终止密码子），选择外显子3作为条件性敲除区域；（2）设计与构建打靶载体质粒：使用来自C57BL/6J文库的BAC克隆RP23
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74A9或RP23
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114L20作为模板，通过PCR产生同源臂和CKO区域；在打靶载体中，Neo盒的侧翼为Frt位点，CKO区域的侧翼为LoxP位点，DTA将用于阴性选择；（3）ES细胞电转和阳性克隆筛选后，进行ES显微注射和制备嵌...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄轶，曾欣，冯金梅，徐小惠，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：