核酸多联体产物的表达制造技术

提供了使用一种或多种核酸多联体产生表达产物的技术，所述核酸多联体包含编码一种或多种表达产物的核酸序列的串联重复。在一个实施方案中，可使用彼此具有预定义比率的第一核酸多联体和第二核酸多联体的多联体混合物共表达不同的表达产物。表达不同的表达产物。表达不同的表达产物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸多联体产物的表达
[0001]序列表本申请含有以ASCII格式电子提交的序列表，且通过引用将其整体并入本文。创建于2019年5月15日的所述ASCII副本被命名为324586
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1_SL.txt且大小为13,566字节。


[0002]本公开总体上涉及核酸多联体的重组产物的表达，并且在某些实施方案中，涉及核酸多联体的重组产物的按比率共表达。已经在体内和无细胞表达系统中证实了按比率共表达。

技术介绍

[0003]重组产物，包括蛋白、抗体和核酸，已广泛用于临床应用。这样的重组产物可利用核酸和/或蛋白表达机制以产生具有临床效用的目的产物。例如，免疫疗法和其它细胞疗法频繁地利用病毒载体来递送遗传有效负荷以治疗特定的疾病靶标。在一个实例中，用于细胞的基因修饰的有效负荷的病毒载体递送可用于治疗某些类型的血液癌，所述细胞具有用于CAR
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T免疫疗法的嵌合抗原受体。病毒载体的其它应用包括在癌症疫苗、单基因疾病和感染性疾病中的应用。
[0004]重组DNA技术已经用于生产重组产物。然而，某些所需的产品可涉及复合的或以其他方式一起起作用的多个组分。这种多组分表达产物的生产可能是复杂的。生产重组产物的一种常见方法可涉及将不同组分分离到多个质粒。例如，多个质粒构建体的共表达可在体内和体外环境中进行。在一些实例中，可将多个质粒构建体瞬时转染到培养细胞中，并且使用那些培养细胞产生所需的重组产物，例如病毒载体、蛋白等。
[0005]然而，某些挑战与在细胞中使用多个质粒构建体有关。挑战之一是对多个质粒构建体的共表达的比率控制。例如，已经报道当每个质粒构建体编码不同的蛋白时，在单个细胞内的转染程序中来自相应质粒的两种(或更多种)蛋白的共表达可导致蛋白以广泛变化的比率表达，其中细胞亚群仅表达所需蛋白之一。
[0006]已经尝试了若干种方法以在单个活细胞中改善对蛋白的共表达比率的控制和实现所需的蛋白比率。例如，可构建多顺反子质粒而不是使用两个或更多个分开的质粒。例如，具有内部核糖体进入位点(IRES)和病毒2A肽的单个双启动子质粒可用于驱动具有降低的异质性的两种或更多种蛋白的共表达，尽管这需要费力地将每个开放阅读框克隆到多顺反子质粒中并因此增加质粒构建体的尺寸的代价。此外，由于质粒含有在细菌中维持所必要的另外的序列，使用质粒需要生产后纯化和QC分析以证明质粒生产中不存在细菌污染物，这对cGMP(临床良好制造)过程提出了重大挑战。后者尤其具有挑战性，因为质粒构建体的尺寸增加并且变得难以与细菌染色体DNA区分，这使得质粒DNA的生产后纯化复杂化。
[0007]因此，仍然存在对用于在体外和体内表达系统中可靠地控制重组产物表达的系统和方法的需要，尤其是用最少的人工制备。

技术实现思路

[0008]下文阐述本文所公开的某些实施方案的概述。应当理解，呈现这些方面仅用于向读者提供所述某些实施方案的简要概述，并且这些方面不旨在限制本公开的范围。实际上，该公开可涵盖以下可能未阐述的多个方面。
[0009]在一个实施方案中，提供了一种方法，其包括以下步骤：配制包含彼此具有预定义比率的至少第一核酸多联体和第二核酸多联体的多联体混合物，其中所述第一核酸多联体包含第一核酸序列的串联重复，而其中所述第二核酸多联体包含第二核酸序列的串联重复；以及共表达所述多联体混合物以由所述第一核酸序列产生第一表达产物和由所述第二核酸序列产生第二表达产物。
[0010]在另一个实施方案中，提供了一种方法，其包括以下步骤：配制包含预定义比例的至少两种核酸多联体的混合物，其中所述核酸多联体中的每一种包含两种或更多种核酸序列的串联重复；并且共表达所述混合物以从所述混合物中的每种核酸多联体产生两种或更多种表达产物。
[0011]在另一个实施方案中，提供了一种方法，其包括以下步骤：使用链置换滚环扩增来扩增包含第一核酸序列的至少一种模板，以产生包含所述第一核酸序列的串联重复的第一多联体；使所述第一多联体与包含第二核酸序列的串联重复的第二多联体接触以形成多联体混合物，所述多联体混合物具有所述第一核酸多联体与所述第二核酸多联体的预定义比率；共表达所述多联体混合物以由所述第一核酸序列产生第一表达产物和由所述第二核酸序列产生第二表达产物，其中所述第一表达产物与所述第二表达产物的比率和所述多联体混合物中所述第一核酸多联体与所述第二核酸多联体的预定义比率成比例。
[0012]在另一个实施方案中，提供了一种方法，其包括以下步骤：配制包含彼此具有预定义比率的至少一种核酸多联体和至少一种质粒的混合物，其中所述至少一种核酸多联体包含第一核酸序列的串联重复，并且其中所述至少一种质粒包含第二核酸序列；以及共表达所述混合物以由所述第一核酸序列产生第一表达产物和由所述第二核酸序列产生第二表达产物。
[0013]在另一个实施方案中，首先提供转染的细胞并用核酸多联体瞬时转染，所述核酸多联体包含核酸序列的串联重复，并在转染细胞中表达编码表达产物的核酸序列中的至少一个开放阅读框。在一个实施方案中，所提供的转染细胞已经用一种或多种核酸多联体和/或一种或多种质粒转染。以这种方式，可用核酸多联体顺序转染细胞。在一个替代的实施方案中，转染的细胞在用核酸多联体转染之前稳定表达一种或多种所需产物。
附图说明
[0014]当参照附图阅读以下详细描述时，本公开的这些和其他特征、方面和优点将变得更好理解，在所有附图中，相同的字符表示相同的部分，其中：图1是根据本公开的实施方案用在表达系统中以产生所需表达产物的多联体的产生的示意图；图2是根据本公开的实施方案用在共表达系统中以产生一种或多种所需的表达产物的两种或更多种多联体的产生的示意图；图3是根据本公开的实施方案的共表达系统的潜在终产物的示意图；
图4是根据本公开的实施方案的共表达系统的潜在复合终产物的示意图；图5是根据本公开的实施方案的彼此作用或作用于共表达系统的另一核酸或蛋白的潜在终产物的示意图；图6是根据本公开的实施方案的混合表达策略的示意图，其中使用多联体表达多产物系统的所有或一些所需的表达产物；图7是根据本公开的实施方案的慢病毒载体产物表达的实施方案的示意图；图8是根据本公开的实施方案的慢病毒载体产物表达的实施方案的示意图；图9是根据本公开的实施方案的腺伴随病毒载体产物表达的实施方案的示意图；图10是根据本公开的实施方案的CRISPR产物表达的实施方案的示意图；图11是显示根据本公开的实施方案的腺伴随病毒(AAV)衣壳蛋白的化学计量表达的琼脂糖凝胶照片；图12是显示根据本公开的实施方案的轻链和重链多肽的化学计量表达的琼脂糖凝胶照片；图13是表明根据本公开的实施方案，从完整的滚环扩增产生的多联体、滚环扩增产生的线性消化物和以不同浓度(18％和2％)转染到幼稚细胞中的质粒的AAV产生的条形图。
[0015]图14是表明根据本公开的实施方案从混合的多联体和质粒表达产物来源的AAV产生的条形图；以及图15是表明根据本公开的实施方案从混合的多联体和质粒表达产物来源的慢病毒产生的条形图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1. 一种方法，其包括：配制包含彼此具有预定义比率的至少第一核酸多联体和第二核酸多联体的多联体混合物，其中所述第一核酸多联体包含第一核酸序列的串联重复，而其中所述第二核酸多联体包含第二核酸序列的串联重复；且共表达所述多联体混合物以由第一核酸序列产生第一表达产物和由第二核酸序列产生第二表达产物。2.根据权利要求1所述的方法，其包括使用滚环扩增产生第一核酸多联体和第二核酸多联体。3.根据权利要求2所述的方法，其包括使用滚环扩增以扩增环状或质粒DNA以产生第一核酸多联体和/或第二核酸多联体。4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中第一串联重复和/或第二串联重复是所述环状或质粒DNA的至少一部分的串联重复。5.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其包括用所述多联体混合物转染培养的细胞以引起共表达，或其中所述共表达在无细胞表达系统中。6.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其中所述第一核酸多联体、所述第二核酸多联体或两者的长度超过10kb。7.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其包括收集所述第一表达产物和所述第二表达产物。8.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其中所述第一核酸多联体或所述第二核酸多联体中的一个或两者在所述共表达之前未经处理。9.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其中所述第一表达产物是病毒的包膜蛋白或包装蛋白，而所述第二表达产物包含所述病毒的转基因，其中所述第一表达产物和所述第二表达产物形成用于递送所述转基因的病毒载体。10.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其中所述第一表达产物是核酸产物而所述第二表达产物是蛋白产物。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一表达产物与所述第二表达产物形成复合物。12.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其中所述第一表达产物作用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：环球生命科技咨询美国有限责任公司，
类型：发明
国别省市：