一种抗人CD47的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了抗人CD47的单克隆抗体，其重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域如SEQ ID NO.1-3所示，其轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域如SEQ ID NO.5-7所示。本发明专利技术还提供了所述单克隆抗体的用途。本发明专利技术所抗体与CD47蛋白具有高亲和性，Kd值为0.2991

【技术实现步骤摘要】
一种抗人CD47的单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种抗人CD47的单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]CD47又称整合素相关蛋白(IAP)，为免疫球蛋白超家族的成员之一，是一个五次跨膜蛋白，由这五次跨膜区域片段以及一个短小的羟基端胞质尾区构成。CD47蛋白有3个结构域，其中一个IgV样细胞外结构域，已经证明能直接结合到信号调节蛋白α(SIRPα)上。SIRPα首次被发现是作为一种特异性的表达于脑组织细胞表面的糖蛋白的形式。当SIRPα与CD47相互作用后，介导SIRPα胞内域酪氨酸磷酸化，而SIRPα反作用于CD47使其胞内域的Cdc42被激活。
[0003]CD47是一个广泛表达的抗原，存在于大多数组织的多种细胞上。并且，CD47在大多数肿瘤细胞上的表达高于其相应的正常细胞，如肝癌、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌等多种实体瘤细胞，以及AML、CML、ALL、NHL、MM等多种血液肿瘤。研究表明，CD47的高表达与不良预后相关。CD47作为最重要的“自我”识别分子，在免疫识别尤其是固有免疫识别中发挥着关键作用，被认为是调节固有免疫的检验点分子。CD47与骨髓来源的固有免疫细胞尤其是巨噬细胞表面的免疫负调控分子，SIRPα结合，释放“do not eat me”信号，从而抑制巨噬细胞的吞噬作用，是肿瘤逃避免疫攻击的机制之一。
[0004]因此，阻断CD47与SIRPα的结合对于恢复抗肿瘤免疫反应，从而获得有效的肿瘤免疫治疗，是一个非常有希望的治疗策略。
[0005]目前以肿瘤治疗为目的提出了多种靶向CD47/SIRPα的策略。例如，将人SIRPα的结合域修饰成高亲和变体，同样的，CD47的变体也用于肿瘤免疫治疗。另外，抗体或者其他靶向CD47/SIRPα的阻断性药物能够阻断肿瘤细胞和巨噬细胞的相互作用从而诱导吞噬作用，具有有效治疗肿瘤的潜力。
[0006]对CD47的运用不是一帆风顺的。2012年6月，Celgene公司的CD47抗体CC-90002试验项目成立，此项目的临床前动物实验表明，CD47抗体CC-90002几乎对所有的肿瘤类型都有效果。然而在2018年底，Celgene公司中止了CD47单抗CC-90002用于治疗AML和MDS的单药临床试验。
[0007]CD47在红细胞上的表达量是随着细胞周期发生变化的，这种细胞表面表达量的变化使得衰老的红细胞表面CD47的表达量减弱，促使巨噬细胞对其进行吞噬，以保证红细胞在体内的平衡。然而，由于CD47药物的干预，在促进巨噬细胞清除肿瘤细胞的同时，由于正常血液系统表面CD47表达，因此CD47/SIRPα信号通路会参与红细胞吞噬过程的调节，也一定程度上参与血小板及淋巴细胞的调节，导致不可避免的误伤红细胞，导致红细胞凝集。在临床中，血液系统副作用例如贫血、血小板减少症成为限制CD47在临床上使用的限制因素，从而影响靶向CD47抗体药物的临床应用前景。

技术实现思路

[0008]本专利技术要解决的技术问题是降低CD47抗体的副作用，筛选出减少或者消除血红细胞结合力的CD47抗体。
[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种新型鼠抗人CD47抗体，在能够在人CD47和人或鼠SIRPα的结合中起到阻断作用，可应用于肿瘤免疫治疗。更重要的是，2C8在体外血细胞凝集试验中表现出良好的安全性。
[0010]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种新型鼠抗人CD47抗体及其可变区序列，本抗体与CD47特异性强，其可变区序列可用于构建基因工程抗体，在体外不引起血细胞凝集，并且已经在体内外验证了其抗肿瘤活性。
[0011]本专利技术提供一种抗原结合蛋白，具有SEQ ID NO.1-3所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。
[0012]优选地，所述抗原结合蛋白具有SEQ ID NO.5-7所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；更优选地，所述抗原结合蛋白选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、dAb、互补决定区片段、单克隆抗体、单链抗体、单结构域抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
[0013]所述的抗原结合蛋白其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的或具有与其80％以上同一性，和/或轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的或具有与其80％以上同一性。
[0014]所述的抗原结合蛋白，其重链可变区核苷酸序列如SEQ ID No.9所示或具有与其80％以上同一性，和/或其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的或具有与其80％以上同一性
[0015]在本专利技术的实施例中，提供的抗原结合蛋白为单克隆抗体。
[0016]作为优选，所述单克隆抗体由选自SP2/0、YB2/0、IR983F、人骨髓瘤Namalwa、PERC6或CHO细胞系的细胞产生。
[0017]本专利技术具体提供了一种抗人CD47的单克隆抗体，其由保藏编号为CGMCC No.17683的细胞产生。
[0018]本专利技术还提供所述的抗原结合蛋白或单克隆抗体在制备检测或治疗肿瘤药物的用途。
[0019]作为优选，所述肿瘤包括但不限于Burkitt淋巴瘤或结肠癌。
[0020]本专利技术还提供了保藏号为CGMCC No.17683的鼠抗人CD47的杂交瘤细胞株2C8。
[0021]本专利技术还提供了由保藏号为CGMCC No.17683的鼠抗人CD47的杂交瘤细胞株2C8产生的鼠抗人CD47单克隆抗体。
[0022]本专利技术还提供了一种核苷酸分子，所述的核苷酸分子编码上述鼠抗人CD47单克隆抗体。所述的核苷酸分子编码鼠抗人CD47单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；编码鼠抗人CD47单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0023]上述杂交瘤细胞株2C8的编号为CGMCC No.17683，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2019年5月15日。
[0024]本专利技术通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选，运用RT-PCR克隆Ig可变区基因，获得1株
能够稳定分泌CD47抗体的杂交瘤，鉴定出其可变区序列，并用流式细胞术对抗体结合特异性进行了检测，所述CD47单克隆抗体2C8与CD47蛋白具有高亲和性，Kd值为0.2991
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M，结合特异性强，能够特异性结合CD47阳性细胞系Jurkat与敲降细胞系CD47shRNA-GFP-Jurkat的结合弱。且本专利技术所述CD47单克隆抗体2C8能够显著体外促进人和小鼠巨噬细胞吞噬肿瘤。
[0025]本专利技术提供的CD47单克隆抗体2C8能够有效抑制NOD/SCID鼠Burkitt
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗原结合蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO.1-3所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。2.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其特征在于，还具有SEQ ID NO.5-7所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。3.根据权利要求1或2所述的抗原结合蛋白，其特征在于，所述抗原结合蛋白选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、dAb、互补决定区片段、单克隆抗体、单链抗体、单结构域抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。4.根据权利要求1、2或3所述的抗原结合蛋白，其特征在于，其为单克隆抗体。5.根据权利要求4所述的抗原结合蛋白，其特征在于，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的或具有与其80％以上同一性，和/或轻链可变区氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊冬生，林芳珍，卢杨，王建祥，张砚君，范冬梅，熊梦裳，叶舟，张益枝，
申请(专利权)人：克拉玛依市中心医院，
类型：发明
国别省市：