检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的引物对、扩增试剂、试剂盒、检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的引物对、扩增试剂、试剂盒、检测方法和应用。本发明专利技术通过设计检测传染性皮下及造血组织坏死病毒的引物对，该引物对由引物IHHNV

【技术实现步骤摘要】
检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的引物对、扩增试剂、试剂盒、检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，进一步地说，是涉及一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的引物对、扩增试剂、试剂盒、检测方法和应用。

技术介绍

[0002]传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)为单链DNA病毒，其基因组序列大小为4.1kb左右，病毒粒子的大小仅仅为20
‑
22nm，为二十面的球状类结构。
[0003]IHHNV，在二十世纪八十年代初首次发现于美国一个养殖场内，最早爆发在于细角滨对虾中(Litopenaeus stylirosiris)，随后在美洲和亚洲的养殖对虾中也有发现，IHHNV几乎可以对所有的对虾造成感染。IHHNV最敏感宿主是红额角对虾，能够对其造成高的致病率和死亡率(90％)，还可以使斑节对虾以及凡纳滨对虾等出现“矮小残缺综合症”(Runt
‑
deformity syndrome,RDS)。
[0004]IHHNV主要感染神经索、前后肠上皮细胞、表皮、鳃以及中胚层器官如横纹肌的细胞核、结缔组织、淋巴器官、性腺、触角腺和外胚层组织如神经节等，病情严重时通常是由于内胚层器官如肝胰腺和肠等也受到了感染。
[0005]IHHNV能够导致红额角对虾出现急性感染的症状，患病对虾行为异常，虾体翻转静卧水底或慢浮水面，其腹部朝上，并且不断重复该行为，直至被其它虾吞食攻击。病虾活力减弱，不能敏锐的感受外界刺激，通常于脱壳时或刚刚脱壳后死亡，病虾表皮上皮尤其是甲壳腹部出现淡黄色或者白色的斑点，继而该斑点会慢慢消失，其中斑节对虾与细角滨对虾濒临死亡时虾体颜色呈现为蓝色，肌肉发白，肠道空肠，细胞核肿大，且细胞核内出现包涵体，感染后未死亡的虾常常静卧不动，在恢复后急性期内仍然不可以正常生长摄食，而且，不能够很好的应对不良环境，在附肢与鳃出现黑斑，不能和正常虾一样按时的蜕壳，IHHNV还能够使日本囊对虾、斑节对虾和凡纳滨对虾呈现“矮小残缺综合症”(RDS)，患病虾吻部和角质层出现畸形、永久不能长大等，大大降低养殖产量，造成巨大的经济损失。
[0006]现有的IHHNV检测方法包括组织病理学法、酶联免疫吸附试验法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、荧光定量PCR检测技术、组织学、环介导等温扩增技术(loop
‑
mediated isothermal amplification,LAMP)、普通PCR等，以上几种技术均可以实现在样品中的检测。
[0007]但现有的IHHNV检测技术检测主要是通过PCR方法，但是该方法对仪器的依赖性太大，同时耗时长，不利于现场快速检测。
[0008]因此，若能开发建立一种简便的检测IHHNV的方法具有重要的意义。

技术实现思路

[0009]为解决现有技术中出现的问题，本专利技术提出了一种用于检测对虾传染性皮下及造
血组织坏死病毒的引物对、扩增试剂、试剂盒、检测方法和应用，可以明显缩短对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测时间；同时检测环节操作更加简单，灵敏度高和特异性更好。满足快速检测及使用方便的试剂需求。
[0010]本专利技术的目的之一是提供一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的引物对，所述引物对由引物IHHNV
‑
F和IHHNV
‑
R组成，
[0011]所述IHHNV
‑
F为SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子；
[0012]所述IHHNV
‑
R为SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子；
[0013]IHHNV
‑
F：CTTCACCATTACAGATCATGGTGACCACTGGCA(SEQ ID NO.1)
[0014]IHHNV
‑
R：CAAGAGATGGATACTCTATCTTATCAGATACG(SEQ ID NO.2)
[0015]本专利技术的目的之二是提供一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的扩增试剂，所述扩增试剂含有权利要求1所述引物对。
[0016]优选的，所述扩增试剂还包括荧光探针IHHNV
‑
P，所述荧光探针IHHNV
‑
P如SEQ ID NO.3所示。
[0017]所述荧光探针EHP
‑
P如下：
[0018]5’‑
ACCAATAAGACCAGACATAGAGCTACAATCCTCHCCTATTTGGGAGTTAC
‑3’
(SEQ ID NO.3)
[0019]其中，32位碱基T标记荧光基团(FAM
‑
dT)，34位碱基H表示四氢呋喃连接子(THF)，37位碱基T标记荧光淬灭基团BHQ1
‑
dT，3'末端标记有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团(如C3
‑
SPACER)，在RPA体系中引入带荧光标记的探针，配合相应扩增引物，可以有效提高RPA检测的特异性。
[0020]优选的，所述扩增试剂还包括缓冲液、醋酸镁和无菌水。
[0021]本专利技术的目的之三是提供一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的扩增试剂盒，所述扩增试剂盒含有本专利技术的目的之一的引物对，或本专利技术的目的之二的扩增试剂。
[0022]优选的，所述试剂盒还含有酶混合液；所述酶混合液中包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶。
[0023]优选的，所述酶混合液中包括T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvs X和uvs Y、单链结合蛋白gp32和Bsu DNA聚合酶。
[0024]优选的，所述扩增试剂盒中，所述引物IHHNV
‑
F的浓度为0.44μmol/L；所述引物IHHNV
‑
R的浓度为0.44μmol/L；所述探针IHHNV
‑
P的浓度为0.2μmol/L。
[0025]本专利技术的目的之四是提供一种本专利技术的目的之一的引物对或本专利技术的目的之二的扩增试剂或本专利技术的目的之三的扩增试剂盒在对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒检测中的应用。
[0026]本专利技术的目的之五是提供一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的RPA检测方法，采用本专利技术的目的之三的扩增试剂盒进行检测，包括如下步骤：
[0027]1)提取待测对虾的DNA；
[0028]2)以该DNA为模板，采用所述引物对和荧光探针进行RPA扩增，在扩增过程中用荧光检测装置同时检测反应体系荧光信号变化，根据荧光信号变化的时间和强度对对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒进行定性和定量检测。
[0029]优选的，所述RPA扩增的条件为37～41℃，反应15～50min。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的引物对，其特征在于，所述引物对由引物IHHNV
‑
F和IHHNV
‑
R组成，所述IHHNV
‑
F为SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子；所述IHHNV
‑
R为SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子。2.一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的扩增试剂，其特征在于，所述扩增试剂含有权利要求1所述引物对。3.根据权利要求2所述的扩增试剂，其特征在于，所述扩增试剂还包括荧光探针IHHNV
‑
P，所述荧光探针IHHNV
‑
P如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求2所述的扩增试剂，其特征在于，所述扩增试剂还包括缓冲液、醋酸镁和无菌水。5.一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的扩增试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂盒含有权利要求1所述的引物对，或权利要求2
‑
4任一所述的扩增试剂。6.根据权利要求5所述的扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有酶混合液；所述酶混合液中包括重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娜，李家侨，郑晓聪，仇保丰，谢艳辉，刘骁，杨劲，李红权，刘建芳，李军，斯泽恩，郑枢尹，
申请(专利权)人：湛江海关技术中心，
类型：发明
国别省市：