用于鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的PCR方法及应用技术

本发明专利技术提供了用于鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的PCR方法及应用，属于动物种源性成分分子检测技术领域。本发明专利技术根据中蜂和意蜂基因组DNA的特异性条带差异来鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。采用本发明专利技术的引物对进行PCR扩增处理后蜂蜜样品，中蜂蜂蜜于194bp处出现特异性条带，而意蜂蜂蜜于330bp处出现特异性条带，两者的掺和蜂蜜样品同时能扩增出194bp和330bp两条特异性条带，由此可以快速、准确地鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。本发明专利技术具有简便、快捷、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。适用性广。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的PCR方法及应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的核酸序列、方法及应用。

技术介绍

[0002]蜂蜜作为一种广泛食用的天然保健食品，自古以来就一直深受消费者喜爱。蜂蜜除了含有丰富的糖类，还含有多种微量成分，包括游离氨基酸、蛋白质、酚类化合物、矿物质、维生素和有机酸等(Ouchemoukh et al.2005,Da Silva et al 2016)；同时，蜂蜜还在抗炎抗氧化等方面起到作用。因此，蜂蜜受到越来越多消费者的青睐。
[0003]我国是养蜂大国，养蜂业已成为我国现代农业的重要组成部分。我国的蜜蜂养殖量、蜂产品产量和出口量均处于世界首位。据中国养蜂学会2018年统计数据显示，我国年产蜂蜜47.9万吨、蜂王浆3000吨，蜂蜡6000吨、蜂花粉4000吨、蜂胶350吨。中华蜜蜂(Apis cerana cerana)，简称中蜂，意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)，简称意蜂，其中，中蜂年产蜜量为5
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10万吨，意蜂年产蜜量约40万吨(张言政.中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜蜂种来源真实性研究[D].杭州:浙江大学，2019.)。基于中蜂蜜的低产量，以及部分消费者对传统土蜂蜜的偏爱，中蜂蜜的价格是意蜂蜜的数倍，市场上也存在将意蜂蜜掺入或伪造成中蜂蜜进行销售的现象。
[0004]目前鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法主要集中在通过鉴别蜂蜜中蛋白成分差异(例如申请号为CN201510999246.9的一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，申请号为CN201610545277.1为基于王浆主蛋白成分鉴别中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的方法)或者辨别蜂蜜中有机成分差异(如申请号为CN201810008004.2的一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，申请号为CN202010197053.2的吲哚
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乙酸甲酯在鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中的应用，申请号为CN202011120746.8的一种区分中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的方法)。在鉴别技术上也有通过液相色谱质谱分析技术(如申请号为CN202010198016.3的的一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法)来达到鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的目的。但通过蛋白检测区分中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜耗时较长，而液相色谱质谱分析对仪器要求较高，且操作人员要求专业技术人员，在实际应用中存在有局限性。
[0005]随着现代分子生物学的发展，以聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术在鉴别产品动物源性中起到重要作用。目前已有研究通过线粒体DNA来鉴别蜂蜜的物种来源(Kim，C.
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K.；Lee,D.C.；Choi，S.
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H.Detection of Korean Native Honey and European Honey by Using Duplex Polymerase Chain Reaction and Immunochromatographic Assay.Korean J.Food Sci.Anim.Resour.2017，37，599.)，但线粒体DNA拷贝数较多，在不同组织中含量不同，稳定性较差。动物核基因组DNA序列具有高度的物种特异性，避免非特异性扩增，更加适合PCR定性定量分析。针对核基因组DNA，国内也有研究通过王浆主蛋白2基因设计引物对中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜进行鉴定(张言政.中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜蜂种来源真实性研究[D].杭州：浙江大学，2019.)，其提出采用双重PCR和荧光定量PCR鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。其中，双
重PCR方法能够鉴别中蜂蜂蜜里1％比例意蜂蜂蜜的掺入，但该方法对混合蜂蜜中含有的中蜂蜂蜜检测效果不佳，且未提出中蜂引物的灵敏度，因此在实际应用中可能会导致假阴性；而所开发的荧光定量PCR并未明确指出鉴别的灵敏度且荧光定量PCR因容易受到仪器设备的限制，成本较高。因此，亟需一种特异性强、灵敏度高、成本较低的PCR方法来鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供用于鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜核苷酸序列和PCR方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：
[0008]用于鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的核苷酸序列，其包括用于能同时扩增SEQ ID No.1所示序列与SEQ ID No.2所示序列的引物对。
[0009]如上所述的核苷酸序列，优选地，其包括用于检测中蜂蜂蜜的引物对如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的序列和用于检测意蜂蜂蜜的引物对如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列。
[0010]用于鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的检测试剂盒，其包括如上所述的核苷酸序列。
[0011]如上所述的检测试剂盒，优选地，还包括2
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Taq DNA MasterMix。
[0012]一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的PCR方法，其包括如下步骤：
[0013]S1、提取蜂蜜的基因组DNA，
[0014]S2、采用如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物序列对提取的蜂蜜基因组DNA进行PCR扩增；
[0015]S3、对扩增产物进行电泳，判断结果。
[0016]如上所述的PCR方法，优选地，在步骤S1中，提取蜂蜜的DNA前的预处理为将蜂蜜先加入无菌水稀释，振荡混匀，40℃孵育10min，7000r/m离心30min，弃上清；将沉淀悬浮于超纯水中，13000r/min离心20min，弃上清，保留沉淀物用于提取DNA。
[0017]如上所述的PCR方法，优选地，在步骤S2中，PCR扩增的反应体系中各引物对中引物的终浓度为0.25μmol/L，反应程序为：94℃初始预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
[0018]如上所述的PCR方法，优选地，在步骤S3中，电泳结果中若出现有194bp大小的特异性条带，说明含有中蜂蜂蜜，若出现有330bp大小的特异性条带，说明含有意蜂蜂蜜，如果有194bp、330bp两条条带都存在，说明中蜂蜂蜜中掺和有意蜂蜂蜜。
[0019]如上所述的PCR方法在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜鉴别中的应用。
[0020]本专利技术的有益效果在于：
[0021]本专利技术提供的一种中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的鉴别方法，根据中蜂和意蜂基因组DNA的特异性条带差异来鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。采用本专利技术的特异性引物PCR扩增处理后的蜂蜜样品，中蜂蜂蜜于194bp处出现特异性条带，而意蜂蜂蜜于330bp处出现特异性条带，两者的掺和蜂蜜样品同时能扩增出194bp和330bp两条特异性条带。本专利技术通过区别不同蜂蜜的特异性条带来达到鉴别目的，可以快速、准确地鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。本专利技术具有简便、快捷、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的核苷酸序列，其特征在于，其包括用于能同时扩增SEQ ID No.1所示序列与SEQ ID No.2所示序列的引物对。2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，其包括用于检测中蜂蜂蜜的引物对如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的序列和用于检测意蜂蜂蜜的引物对如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的序列。3.用于鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的核苷酸序列。4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，其还包括2
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Taq DNA MasterMix。5.一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的PCR方法，其特征在于，其包括如下步骤：S1、提取蜂蜜的基因组DNA，S2、采用如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物序列对提取的蜂蜜基因组DNA进行PCR扩增；S3、对扩增产物进行电泳，判断结果。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：梁爱心，周翔，吕策，李翔，王文君，杨利国，张淑君，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：