一种骨髓间充质干细胞外泌体及其制备与应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞分泌的外泌体及其在制备缓解癌性疼痛和抑制癌细胞增殖药物方面的应用。所述外泌体是以培养过肿瘤细胞的培养液培养骨髓间充质干细胞后收集培养液，并从培养液中收集获得。相比于现有技术，即骨髓间充质干细胞直接分泌的普通外泌体，本发明专利技术肿瘤细胞培养液刺激骨髓间充质干细胞后分泌的诱导外泌体，诱导外泌体表达抗伤害感受因子更强，使得相应蛋白表达增加，进而更加有效缓解由肿瘤引起的癌性疼痛，同时能够增强对癌细胞增殖的抑制作用。制作用。制作用。

【技术实现步骤摘要】
一种骨髓间充质干细胞外泌体及其制备与应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种骨髓间充质干细胞分泌的外泌体及其在制备缓解癌性疼痛和抑制癌细胞增殖药物方面的应用。

技术介绍

[0002]癌性疼痛（Cancer pain）是疼痛部位需要修复或调节的信息传到神经中枢后引起的感觉，别名，癌痛，晚期癌痛，是造成癌晚期患者主要痛苦的原因之一。在疼痛患者中，因各种原因使50%～80%的疼痛没有得到有效控制。
[0003]间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSC）是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。
[0004]骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSC), 既往称为骨髓基质成纤维细胞，是一类起源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能，可分化为多种间质组织，如骨骼、软骨、脂肪、骨髓造血组织等。
[0005]外泌体（Exosome）是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30
‑
150nm)，现今，其特指直径在40
‑
100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞
‑
细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。近年来，其应用已经涉及肿瘤治疗领域、医学基础和免疫领域、化妆品领域等。

技术实现思路

[0006]本专利技术解决的技术问题是提供一种外泌体及外泌体疗法，作为一种新的治疗药剂，为当前难以治疗的癌性疼痛带来一些新的机会，提出了在缓解癌性疼痛和抑制癌细胞增殖方面的应用。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案之一，是一种骨髓间充质干细胞分泌的外泌体，所述外泌体是由肿瘤细胞培养液刺激骨髓间充质干细胞产生；所述肿瘤细胞包括但不限于皮肤肿瘤细胞、软组织肿瘤细胞、转移性骨肿瘤的原发肿瘤细胞等；进一步地，所述皮肤肿瘤细胞包括但不限于黑素瘤细胞、基底细胞癌细胞、鳞状细胞癌细胞；进一步地，所述软组织肿瘤细胞包括但不限于纤维肉瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、平滑肌肉瘤细胞、淋巴管肉瘤细胞；进一步地，所述转移性骨肿瘤的原发肿瘤细胞包括但不限于乳癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞、直肠癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞。
[0008]本专利技术提供的技术方案之二，是上述外泌体的制备方法，是以培养过肿瘤细胞的培养液培养骨髓间充质干细胞后收集培养液，进一步从培养液中收集外泌体；
进一步地，37℃、5% CO2条件下，肿瘤细胞以其适宜培养基贴壁培养至密度约为80
‑
90%时，去除细胞收集培养液；进一步地，可根据肿瘤细胞选择适宜的培养基，如：DMEM培养基、DMEM/F12培养基、1640培养基等；进一步地，骨髓间充质干细胞贴壁培养至密度约为70
‑
80%时，移除原有培养液并用PBS清洗细胞；进一步地，以收集到的肿瘤细胞培养液继续培养上述经过清洗的骨髓间充质干细胞；12
‑
48h后收集培养液，超速离心法收集外泌体沉淀；进一步地，肿瘤细胞培养液的添加量视培养容器的规格采用本领域常用的添加量即可，如10cm左右培养皿添加10mL左右培养液，25cm左右培养皿添加25mL左右培养液等；进一步地，超速离心法是将收集到的培养液以2000
×
g离心10min；离心后吸取上清液，10000
×
g高速离心30 min；再次吸取上清液，140000
×
g 超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体，用生理盐水洗涤沉淀并重悬后，140000
×
g再次离心90 min，适量生理盐水重悬沉淀，直接使用或冻存于
‑
80
°
C备用；优选地，37℃、5% CO2条件下，骨髓间充质干细胞贴壁培养至密度约为70
‑
80%时，移除其原有培养液并清洗，以收集到的肿瘤细胞培养液于37℃、5% CO2条件下继续培养48h；48h后收集培养液，离心获得外泌体沉淀，生理盐水将之重悬，得到外泌体溶液。
[0009]本专利技术提供的技术方案之三，是包含上述外泌体的药物；所述的药物包括但不限于注射剂、胶囊剂、片剂、粉末剂、软膏剂或喷雾剂等形式；本专利技术提供的技术方案之四，是上述外泌体在制备缓解癌性疼痛药物中的应用；本专利技术提供的技术方案之五，是上述外泌体在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用；进一步地，上述外泌体与所述癌性疼痛或癌细胞增殖为一一对应关系，即特定肿瘤细胞培养液培养骨髓间充质干细胞后收集的外泌体，能够抑制对应的癌细胞产生的疼痛或对应癌细胞的增殖，如黑色素瘤细胞培养液培养骨髓间充质干细胞后收集的外泌体，能够抑制黑色素瘤患者的疼痛或者黑色素瘤的增殖；进一步地，所述外泌体为制备癌性疼痛药物或抑制癌细胞增殖药物的唯一活性成分。
[0010]有益效果：骨髓间充质干细胞的迁移、定植、增殖与分化，需要从外界获取信息，其分化方向取决于所在的微环境。以肿瘤细胞培养液特定刺激，促使骨髓间充质干细胞发挥更加具体的功能，由此分泌的外泌体再次应对此刺激便可高效发挥功效。
[0011]相比于现有技术，即骨髓间充质干细胞直接分泌的普通外泌体，本专利技术肿瘤细胞培养液刺激骨髓间充质干细胞后分泌的为诱导外泌体，诱导外泌体表达抗伤害感受因子更强，使得相应蛋白表达增加，进而更加有效缓解由肿瘤引起的癌性疼痛，同时能够增强对癌细胞增殖的抑制作用。
附图说明
[0012]图1为表征以黑色素瘤细胞刺激产生的诱导外泌体与普通外泌体的冷冻透射电镜
图；图2为表征以黑色素瘤细胞刺激产生的诱导外泌体与普通外泌体的蛋白质印迹图；图3为表征以黑色素瘤细胞刺激产生的诱导外泌体与普通外泌体的动态光散射粒径分析图；图4为以黑色素瘤细胞刺激后不同时段产生的诱导外泌体与普通外泌体的BCA蛋白定量图；图5为以黑色素瘤细胞刺激产生的诱导外泌体与普通外泌体对肿瘤细胞的增殖/毒性检测；图6为黑色素瘤细胞外泌体对黑色素瘤细胞增殖的影响；图7为以黑色素瘤细胞刺激产生的诱导外泌体与普通外泌体中ZBTB20、TRPV1、TRPA1、TRPM8 mRNA表达（**标记，表示p值小于0.01，差异极显著）；图8为黑色素瘤细胞、加入诱导外泌体与普通外泌体的黑色素瘤细胞，三组肿瘤细胞中ZBTB20、TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表达（**标记，表示p值小于0.01，差异极显著）；图9为诱导外泌体与普通外泌体对黑色素瘤模型小鼠机械痛阈值、热敏值的影响；图10为诱导外泌体与普通外泌体对软组织肿瘤模型小鼠机械痛阈值、热敏值的影响；图11为诱导外泌体与普通外泌体对骨癌痛模型小鼠负重量的影响；图12为不同肿瘤细胞刺激骨髓间充质干细胞来源本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种骨髓间充质干细胞分泌的外泌体，其特征在于，所述外泌体是由肿瘤细胞培养液于37℃、5% CO2条件下刺激骨髓间充质干细胞产生；所述肿瘤细胞为黑素瘤细胞、纤维肉瘤细胞或肺癌细胞。2.权利要求1所述外泌体的制备方法，其特征在于，以培养过肿瘤细胞的培养液培养骨髓间充质干细胞后收集培养液，从培养液中收集外泌体。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：步骤一： 37℃、5% CO2条件下，肿瘤细胞贴壁培养至密度约为80
‑
90%时，去除细胞收集培养液；步骤二：骨髓间充质干细胞贴壁培养至密度约为70
‑
80%时，移除原有培养液并清洗；步骤三：以收集到的肿瘤细胞培养液继续培养上述经过清洗的骨髓间充质干细胞；12
‑
48h后收集培养液，超速离心法收集外泌体沉淀。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，37℃、5% CO2条件下，骨髓间充质干细胞贴壁培养至密度约...

【专利技术属性】
技术研发人员：张杨，周春晶，
申请(专利权)人：天津市第四中心医院，
类型：发明
国别省市：