基因PnDCD及其在调控皂苷合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基因PnDCD及其在调控皂苷合成中的应用，该基因PnDCD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术以基因PnSE1上游启动子序列为研究对象，利用酵母单杂交方法从三七cDNA文库中筛选到与启动子片段相互作用的转录因子，提供了调控三七皂苷合成的新途径，为探究三七皂苷生物合成途径的转录调控奠定基础。础。础。

【技术实现步骤摘要】
基因PnDCD及其在调控皂苷合成中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，主要涉及基因PnDCD及其在调控皂苷合成中的应用。

技术介绍

[0002]三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]为五加科(Araliaxeae)人参属(Panax)多年生直立草本植物，是我国传统名贵药材之一。三七皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)是三七主要的药用活性成分，由多种四环三萜皂苷组成。已有研究表明三七总皂苷在中枢神经系统、心脑血管系统、血液系统、免疫系统以及抗纤维化、抗衰老、抗肿瘤等方面均具有较好的药理活性。三七对种植环境要求苛刻，生长周期长，轮作障碍严重，其产量难以满足市场的需求，严重制约了三七产业的可持续发展。三七皂苷主要由甲羟戊酸(MVA)途径合成，鲨烯环氧酶(Squalene epoxidase,SE)是其中关键酶，对植物体内的三萜类和甾醇类化合物有着重要的调控作用。
[0003]近年来，药用植物次生代谢合成的基因调控已成为研究热点，且三七基因组测序的完成为三七皂苷生物合成调控机制的阐明以及传统中医药的发展提供了有力的研究与应用基础。转录因子能够作用于多个基因上游的启动子序列实现“多点调控”，影响与次生代谢产物合成相关的多个基因表达。转录因子(Transcription factor)对基因的转录激活是植物次生代谢过程重要的调控环节，而且具有“多点调控”的优势。
[0004]已有研究表明，转录因子能够影响直接参与三七皂苷合成的关键酶基因的表达，进而实现对皂苷合成代谢的调控。基因PnSE1是三七三萜皂苷生物合成途径的关键酶基因。PnSE1是三萜皂苷生物合成途径中的另一个关键酶。研究发现三七中存在两种类型的PnSE基因，PnSE1编码537个氨基酸，在各个植物组织中均有表达，PnSE2编码545个氨基酸，但只在花中表达显著，其余组织较弱。推测PnSE1与PnSE2具有不同的表达模式，PnSE1参与三萜皂苷合成途径，而PnSE2参与甾醇合成途径。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种基因PnDCD及其在调控皂苷合成中的应用，该基因PnDCD为发育和细胞死亡相关蛋白编码基因，与直接参与三七皂苷合成关键酶基因PnSS的启动子有相互作用，进而影响三七皂苷的合成。
[0006]具体技术方案如下：
[0007]本专利技术提供了基因PnDCD，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术提供了一种包含上文所述的基因PnDCD的重组表达载体。
[0009]本专利技术提供了一种包含上文所述的基因PnDCD的基因工程菌。
[0010]本专利技术提供了一种由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的基因PnDCD编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]本专利技术还提供了如上文所述的基因PnDCD或所述的蛋白在与基因PnSE1的启动子
互作中的应用。
[0012]本专利技术还提供了如上文所述的基因PnDCD或所述的基因工程菌在调控皂苷合成中的应用。
[0013]进一步地，所述调控途径为：通过基因PnDCD编码的蛋白与基因PnSE1的启动子结合来调控皂苷的合成。
[0014]本专利技术还提供了如上文所述的蛋白在调控皂苷合成中的应用。
[0015]进一步地，上文所述皂苷为三七皂苷。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0017]本专利技术以基因PnSE1上游启动子序列为研究对象，利用酵母单杂交方法从三七cDNA文库中筛选到与启动子片段相互作用的转录因子，提供了调控三七皂苷合成的新途径，为探究三七皂苷生物合成途径的转录调控奠定基础。
附图说明
[0018]图1为实施例3中PnDCD蛋白二级结构的预测结果；
[0019]其中，α
‑
螺旋：最长的竖直线；延伸链：第二长竖直线；β
‑
转角：第三长竖直线；无规则卷曲：最短竖直线。
[0020]图2为实施例3中PnDCD蛋白三级结构的预测结果。
[0021]图3为实施例3中PnDCD蛋白的系统进化树。
[0022]图4为实施例4中X
‑
α
‑
gal显色反应验证PnSE1(CK)与PnDCD之间的互作结果。
[0023]图5为实施例5中PnDCD蛋白的诱导表达结果。
[0024]图6为实施例6中PnDCD蛋白亚细胞定位图(CK：35S
‑
sGFP)。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述，以下列举的仅是本专利技术的具体实施例，但本专利技术的保护范围不仅限于此。
[0026]实施例1 酵母诱饵菌株的构建
[0027]随机选取PnSE1启动子上的序列片段，每段上都包含主要的顺式作用元件至少一个，将它们通过PCR克隆的方式构建到pAbAi载体中。利用primer premier 5.0设计特异性引物，并利用SnapGene 3.2.1预测序列内可选的酶切位点，选取了SmaI和XhoI两个限制性内切酶位点。采用KOD高保真酶扩增目的片段，将PCR产物于1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离。然后将目的片段进行切胶回收。用SmaI和XhoI对目的片段和pAbAi载体进行双酶切，37℃酶切6h，然后加入5μL的10
×
DNA loading buffer终止酶切反应。将酶切产物于1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离，然后进行切胶回收处理。
[0028]采用T4连接酶将目的片段与载体连接过夜，连接产物全部转化进入大肠杆菌DH5α感受态(100μL)中。挑取单克隆到LB液体培养基(50mg/L Amp)中，扩大培养，然后吸取1μL菌液作为模板进行菌液PCR验证。验证得到的阳性克隆采用TIANGEN的TIANpure Mini Plasmid Kit II(Code No.DP107)进行质粒的提取。
[0029]将上述构建好的诱饵载体用BstBI限制性内切酶进行酶切线性化。纯化后的线性化质粒转入酵母Y1H株系中。酵母诱饵菌株鉴定采用Matchmaker Insert Check PCR Mix I
试剂盒进行。鉴定成功的酵母菌落进行扩大培养，挑选到能被AbA抑制的合适的酵母诱饵菌株YE697。
[0030]实施例2 筛选与PnSE1基因启动子互作的基因
[0031]参照TIANGEN RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒说明书提取三七总RNA。以三七总RNA为模板，经SMART逆转录合成cDNA第一链，利用长距离PCR(LD
‑
PCR)扩增技术合成双链cDNA，并用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，最后用CHROMA SPIN+TE
‑
400层析柱进行纯化，参照Matchmaker Gold Yeast One
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因PnDCD，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种包含权利要求1所述的基因PnDCD的重组表达载体。3.一种包含权利要求1所述的基因PnDCD的基因工程菌。4.一种由权利要求1所述的基因PnDCD编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.如权利要求1所述的基因PnDCD或权利要求4所述的蛋白在与基因PnSE...

【专利技术属性】
技术研发人员：许鑫瀚，夏鹏国，胡婉莹，梁宗锁，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：