抗CK5/6蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种可以识别人CK5/6抗原的单克隆抗体，分泌细胞株、其制备方法以及其在免疫检测中的用途。上述技术方案选取CK5/6蛋白C末端的488

【技术实现步骤摘要】
抗CK5/6蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗CK5/6蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]细胞角蛋白(CKs)家族是一组分布于上皮细胞内的细胞骨架中间纤维丝，其表达具有组织和器官特异性，主要在上皮细胞表达，共有20余个成员。细胞角蛋白5/6(cytokeratin5/6,CK5/6)是一种高分子量的细胞角蛋白，为高分子量的酸性多肽物质，包含CK5和CK6两种分子，主要表达于上皮及粘膜的鳞状上皮，例如肺的鳞状上皮、乳腺、前列腺及唾液腺的基底肌上皮细胞层。其作用和其他细胞角蛋白一样,是维护上皮细胞的形态完整性。检测肿瘤组织的CKs表达，可用以确定该肿瘤为上皮来源或确定上皮成份有无缺失。大部分单层腺上皮不表达CK5/6，对于鳞癌和腺癌有很好的鉴别诊断作用。
[0003]在正常乳腺导管基底细胞层上CK5/6蛋白常常表达。也有研究表明，CK5/6可以作为基底细胞样型乳腺癌的特征性标志物。文献报道，表达CK5/6的乳腺癌患者的生存期是比较短的。还有研究报道，CK5/6已经被认为是乳腺癌独立的预后指标。也有文献报道在乳腺癌患者外周血中，CK5/6阳性细胞的表达与乳腺癌的分期是有关的，其可以作为临床监测和判断预后的参考性指标。目前CK5/6在分子分型中，它是已经作为基底细胞样型乳腺癌的特征性标志物了。

技术实现思路

[0004]专利技术人提供了一种抗CK5/6蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
[0005]进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0006]进一步地，所述单克隆抗体特异性识别CK5/6蛋白。
[0007]进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG2bκ亚型单克隆抗体。
[0008]进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO 21982的杂交瘤细胞株产生。
[0009]专利技术人又提供了一种抗CK5/6蛋白单克隆抗体的制备方法，其用于免疫小鼠的抗原为重组蛋白，所述重组蛋白由大肠杆菌重组表达，包含TRX蛋白标签、CK5/6蛋白片段及His蛋白标签。
[0010]进一步地，所述CK5/6蛋白片段为CK5/6蛋白的488
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590位氨基酸片段，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0011]专利技术人还提供了一株分泌抗CK5/6蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株AbM58019
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7H4，所述细胞株已于2021年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO 21982，地址为北京市朝阳区北辰西路1号
院3号中国科学院微生物研究所。
[0012]专利技术人还提供了上述单克隆抗体在CK5/6蛋白免疫检测中的用途。
[0013]进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。
[0014]专利技术人最后提供了一种CK5/6蛋白免疫组化检测试剂，所述免疫组化检测试剂含有重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的抗CK5/6蛋白单克隆抗体为其有效成分。
[0015]区别于现有技术，本专利技术所产生的有益技术效果为：上述技术方案选取CK5/6蛋白C末端的488
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590位氨基酸为抗原肽，优化成为适合在大肠杆菌BL21表达的基因片段，最后得到的重组蛋白包含TRX蛋白标签、CK5/6蛋白片段及组氨酸蛋白标签。所述重组蛋白对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗CK5/6蛋白单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株AbM58019
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7H4,以及由该细胞株所分泌的抗CK5/6蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达CK5/6蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。
附图说明
[0016]图1为食道鳞癌免疫组化染色结果对比图；其中左为AbM58019
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7H4分泌的CK5/6，右为市售CK5/6。
[0017]图2为食管免疫组化染色结果对比图；其中左为AbM58019
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7H4分泌的CK5/6，右为市售CK5/6。
具体实施方式
[0018]为详细说明技术方案的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
[0019]实施例1重组CK5/6蛋白片段的制备
[0020]一、基因优化与合成
[0021]CK5/6按照Uniprot数据库中登录号为P13647的蛋白质序列，选择488
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590位氨基酸的蛋白片段，直接优化成适合在大肠杆菌BL21表达的基因片段。在PCR的过程中在基因5
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和3
’
端分别加入EcoR I和XhoI酶切位点。
[0022]PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体Pet32a进行EcoRⅠ和XhoI酶切，再次电泳回收，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取平板上的克隆接种，进行菌液PCR鉴定。挑选PCR结果阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆使用。
[0023]选择不同的抗原进行免疫可能制备出不同结合特性的抗体，该分子同时存在多种因可变剪切引起的变异体，最终导致不同抗体对表达抗原细胞的识别能力和模式不同。CK5/6分子按照公布的序列进行分析，依据在细胞质上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达，选择CK5/6的488
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590位氨基酸残基进行密码子优化和重组表达，分子量约为31kDa。通过序列优化设计利用原核表达基因序列获得CK5/6蛋白。而重组免疫原由具有抗原性的CK5/6蛋白片段及用于重组蛋白纯化的蛋白标签组成，蛋白标签为TRX和His。
[0024]二、蛋白表达和纯化
[0025]按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100mL LB培养基，加入终浓度为10μg/mL的卡那霉素，37℃振荡培养至OD600为0.6
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0.8，加入1mmol/L的IPTG，16℃震荡培养过夜，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。用500mmol/L咪唑进行洗脱，SDS PAGE分离检测。
[0026]实施例2杂交瘤细胞系的建立
[0027]一、免疫
[0028]将实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗CK5/6蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别CK5/6蛋白。4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG2bκ亚型单克隆抗体。5.一种抗CK5/6单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO 21982的杂交瘤细胞株产生。6.一种抗CK5/6蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，用于免疫小鼠的抗原为...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵普，杨清海，陈惠玲，王小亚，周洪辉，程本亮，陈昌星，林婷，李萍，
申请(专利权)人：福州迈新生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：