一种猪circRNA序列及其应用、成环鉴定方法技术

本发明专利技术基于最常见的一类肠道炎症性疾病——仔猪细菌性腹泻（PDW），其中F18大肠杆菌（E.coli F18）是引起断奶仔猪细菌性腹泻的主要病原，而地方品种猪对其抗性的调控机制有待系统阐明。前期通过组学测序筛选出1个大肠杆菌F18感染调控的关键候选RNA—circRNA_27388，由于circRNA_27388本体基因为FUT8，因此将其命名为circ_FUT8，在此基础上，本研究对circ_FUT8序列进行成环鉴定，为后续验证circRNA功能及调控机制奠定基础。circRNA功能及调控机制奠定基础。circRNA功能及调控机制奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种猪circRNA序列及其应用、成环鉴定方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及仔猪细菌性腹泻（PDW）circRNA中circ_FUT8的成环验证及其应用。

技术介绍

[0002]F18大肠杆菌是导致当今养猪业断奶仔猪细菌性腹泻的重要致病病原菌之一，它与其所释放的脂多糖直接与小肠上皮细胞上的受体结合，致使小肠上皮细胞发生病变，从而导致仔猪出现水肿和腹泻等症状。因此，断奶仔猪能否抵抗大肠杆菌F18侵染，首要在于小肠黏膜上皮细胞的大肠杆菌F18受体是否表达。国外研究发现1型H抗原，参与组成ABH血型抗原，是F18大肠杆菌黏附受体的最小抗原决定簇，主要由α
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（1, 2）岩藻糖转移酶（FUT2酶）催化，而FUT2酶的功能活性由FUT1和FUT2基因共同调控；国外学者发现FUT1基因可以影响 F18大肠杆菌受体蛋白的表达，且FUT1基因M307位点的遗传突变可作为国外猪大肠杆菌F18腹泻的抗病育种标记，但不适合中国地方猪品种。因此，迫切需要深入探讨断奶仔猪在抵抗大肠杆菌F18侵染时的分子机理，以期挖掘和鉴定与仔猪抵抗大肠杆菌F18侵染存在关联的关键候选基因。
[0003]环状 RNA（circRNA）是近年来继微小RNA（microRNA）和长链非编码 RNA（lncRNA）研究之后发现的一种新的内源性非编码RNA，是RNA研究领域的一个热点。与其他线性非编码RNA不同，circRNA不具备5
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末端帽子和3
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末端poly（A）尾巴，是以共价键形成闭合的连续环（Qu et al., 2015）。随着高通量测序技术的发展，截止到2013年，研究人员已从RNA
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Seq数据中鉴定出人类、小鼠、线虫中的circRNA数目分别为1950种、1903种和724种。目前对circRNA功能的研究主要集中在与miRNA互作、蛋白调控以及癌症等疾病方面，然而关于猪circRNA研究相对比较少。

技术实现思路

[0004]对于F18大肠杆菌引起的仔猪腹泻病，本研究前期以梅山断奶仔猪为对象，通过系统的大肠杆菌感染攻毒试验，经过表型观测和肠段中的菌株定量、组织学检查、肠道中菌株黏附性定量检测、粪便中的菌株定量、大肠杆菌毒力基因的检测等一系列试验，获得了F18大肠杆菌抗性型和敏感型断奶仔猪，并利用多组学测序及联合分析已经筛选出1个关键环状RNA—circRNA_27388，由于circRNA_27388本体基因为FUT8，因此将其命名为circ_FUT8，在此基础上，本研究对circ_FUT8序列进行成环鉴定，为后续验证circRNA功能及调控机制奠定基础。
[0005]有鉴于此，本专利技术实施例提供一种猪肠道circ_FUT8序列成环的鉴定方法，主要目的是为其在仔猪抗大肠杆菌肠道腹泻的功能验证。
[0006]circRNA 的功能验证的前提是候选circRNA在细胞质或者核能以环状的形式存在，方可对其进行进一步的功能展开研究。因此本申请想通过对仔猪肠道circ_FUT8的成环验证，以期获得其标准的操作流程。
[0007]为实现本专利技术的目的，本专利技术采用的技术方案是：第一方面，一种与猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性相关的circRNA，命名为circ_FUT8，其序列如下：CATGTAGAATCCATGAAGCACAGGTAAATAAAGCTTCCTACTGATACCACCAGGAAAATCTCTTTGAAAGAGTCACCACAGGACTACCACAGAGACTAATTTGTCTGAAGCATCATGTGTTGAAACAAGAGAGGACTGCTGGCCTTGCACAAGCTAGAAACAGAGTTACGATGTTTTCAATTCTTTGAGCTCTAGGAAGCCACGAAAGTGAGTTGAAAGTCTGAAAATGCGGCCATGGACTGGTTCGTGGCGTTGGATTATGCTCATTCTTTTTGCCTGGGGGACCTTGCTATTTTACATAGGTGGTCACTTGGTACGAGATAATGACCACTCTGATCACTCTAGCCGAGAACTGTCCAAGATTTTGGCAAAGCTGGAACGCTTAAAACAACAAAATGAAGACTTGAGGAGAATGGCTGAATCTCTCCGAATACCAGAAGGCCCCATTGATCAGGGGCCAGCTTCAGGAAGAGTTCGTGCTTTAGAAGAGCAATTTATGAAGGCCAAAGAACAGATTGAAAATTATAAGAAACAAACTAAAAATGGTCCAGGGAAGGATCATGAAATCCTAAGGAGGAGGATTGAAAATGGAGCTAAAGAGCTCTGGTTTTTTCTACAAAGTGAGTTGAAGAAATTAAAGAATTTAGAAGGAAATGAACTCCAAAGACATGCAGATGAATTTCTATCAGATTTGGGACATCATGAAAGGTCTATAATGACGGATCTATACTACCTCAGTCAAACAGATGGGGCAGGTGATTGGCGTGAAAAGGAGGCCAAAGATCTGACAGAGCTGGTCCAGCGGAGAATAACATATCTTCAG（SEQ ID NO:1）。
[0008]第二方面，提供一种检测仔猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性的试剂，所述试剂检测样品circ_FUT8表达水平。
[0009]优选的，所述的试剂采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品circ_FUT8表达水平。
[0010]优选的，所述的试剂采用高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样品circ_FUT8的表达水平。
[0011]优选的，试剂含有与circ_FUT8杂交的探针或扩增circ_FUT8的特异性引物。更优选的，引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3。
[0012]优选的，所述的试剂，样品为猪小肠上皮组织。
[0013]所述circ_FUT8用于预测或辅助预测猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性中的应用；所述的circ_FUT8用于制备预测或辅助预测猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性的试剂中的应用；所述的circ_FUT8用于选育具有对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性猪中的应用。
[0014]所述试剂用于预测或辅助预测猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性中的应用；所述试剂用于制备预测或辅助预测猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性的试剂中的应用；所述试剂用于选育具有对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性猪中的应用。
[0015]所述的circ_FUT8 的成环鉴定方法，包括：以猪小肠上皮细胞基因组DNA以及反转录cDNA为模板，设计成环引物和定量引物，利用RT
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PCR扩增显示circ_FUT8不能在线性化基因组DNA中扩增出来，仅仅在反转录cDNA文库中；放线菌素D处理猪小肠上皮细胞一定时间后，环状circ_FUT8比本体基因FUT8表现出更好的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.circ_FUT8，序列为SEQ ID NO:1。2.一种检测仔猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性的试剂，所述试剂检测样品circ_FUT8表达水平。3.权利要求2所述的试剂，其特征在于，采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品circ_FUT8表达水平。4.权利要求2所述的试剂，其特征在于，采用高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样品circ_FUT8的表达水平，优选的，试剂含有与circ_FUT8杂交的探针或扩增circ_FUT8的特异性引物。5.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，样品为猪小肠上皮组织。6.权利要求1所述的circ_FUT8的应用，其特征在于，所述circ_FUT8用于预测或辅助预测猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性；或，circ_FUT8用于制备预测或辅助预测猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性的试剂；或，circ_FUT8用于选育具有对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性猪中的应用。7.权利要求2
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5任一项所述的试剂的应用，其特征在于，所述试剂用于预测或辅助预测猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性；或，所述试剂用于制备预测或辅助预测猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性的试剂；或，所述试剂用于选育具有对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性猪中的应用。8.权利要求1所述的circ_FUT8 的成环鉴定方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴正常，许写，周荣，任战士，包文斌，吴圣龙，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：